本周分享的文献是 2023年3月发表在国际杂志Gastroenterology 题为“Macrophage-derived Osteopontin (SPP1) Protects From Nonalcoholic Steatohepatitis”的文章，研究发现MFs衍生的OPN，可以上调OSM，通过STAT3诱导肝细胞内ARG2表达并上调FAO，进而缓解NASH。并且SPP1过表达具有小鼠性别特异性转录谱组成。
背景：
着人类生活质量的不断提升，代谢相关脂肪肝病已成为全球最重要的公共卫生健康，MAFLD以肝脏中脂质蓄积为主，并且还会合并多种不同的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎，而单纯性脂肪肝进展为NASH是MAFLD过程中的重要环节，NASH以脂肪变性，小叶炎症，肝细胞球囊变化以及纤维化为特征，这一系列进展构成了晚期肝脏疾病的风险。有研究报道，在肝损伤期间，大量免疫细胞浸润损伤部位，尤其是巨噬细胞。通过单细胞测序下，已经发现了一群特殊的巨噬细胞群体，其高表达Trem2，Spp1，Gpnmb。然后目前尚未有深入的报道阐明其来源和作用。骨桥蛋白 (osteopomtin，OPN)是一种广泛分布的O-糖基化磷酸蛋白，又被称为分泌性磷蛋白1，骨涎蛋白1，Eta-1等，可以在如上皮，肾，骨和牙齿等的各种组织中表达，也可以在包括血液和母乳在内的所有体液中检测出。 OPN在如细胞粘附和迁移、血管生成、免疫、神经发育和肿瘤转移等许多生理和病理过程中起作用。但其在肝脏巨噬细胞（MFs）中的作用仍不明确。
1. KC中SPP1-mRNA表达较高的患者脂肪变性评分相对较低
作者从公共数据库中发现SPP1的高表达和患者NAS,纤维化评分有显著相关性。对多个RNA-seq数据分析得到与SPP1相关的45个基因。在单细胞数据中还发现了高表达SPP1髓系巨噬亚群。并且通过临床样本证实了在原代KC中SPP1高表达的患者脂肪变性评分相对较低
图 1.Kupffer细胞（KCs）高表达SPP1 mRNA的患者肝脂肪变性评分较低
2. NASH患者和小鼠MF中OPN蛋白表达增加
为了探究SPP1的来源，作者通过人类不同NASH阶段的免疫荧光看到OPN和CD68共定位，且随着阶段的发展，其表达也逐渐增多。此外还通过小鼠IHC和 FISH也观察到了OPN在非实质细胞中的定位。接着，又通过挖掘单细胞数据库GSE129516的髓系相关群体，共得到5个MF亚群。通过DEG和IPA分析，作者猜测SPP1可能具有代谢而非炎症特性。
图 2 NASH患者和小鼠MF中OPN蛋白表达增加
3. MF和肝常驻 SPP1过表达减轻NASH
接着，作者从小鼠的组织水平观察SPP1过表达和敲除的病理状态的改变。通过油红O和HE染色观察到SPP1髓样过表达组在不同性别的小鼠中均比野生型鼠的NASH，脂滴积累，免疫浸润和纤维化程度有所缓解，但雄性效果较好。由于重组小鼠使得肝内及肝外巨噬细胞均敲入了SPP1，所以作者构建了仅肝内MF的SPP1KI鼠，发现同样能够显著减轻NASH水平，且雌雄缓解程度相当。
图 3MF和肝常驻 SPP1过表达减轻NASH
4. SPP1髓系敲除鼠加速NASH进展
作者随后构建了SPP1髓系敲除鼠，造模发现SPP1敲除在早期加重NASH，晚期加重炎症水平。
图 4 SPP1髓系敲除鼠加速NASH进展
5. Spp1 KI Mye小鼠含有较少的包括甘油三酯（TGs）在内的饱和及单一不饱和脂肪酸
为了探究FA代谢是否影响了SPP1 KI Mye小鼠的NASH发展。通过非靶向代谢和脂质组学分析发现，与WT小鼠相比，SPP1KI增加了C原子和双键数，且相关性分析也表明88中相关代谢物和显著下降的甘油三酯有较强的正相关。富集分析主要与氨循环肉碱合成，尿素循环有关。尿素循环代谢物在SPP1KI组中的对照和NASH组均上调。这一点也通过血清中的低氨和高尿素证实。qPCR检测尿素循环相关基因的表达，发现Arg2显著增加且主要在肝细胞中。此外还发现Arg2在疾病时的肝脏分区不同，且3-硝基酪氨酸也在肝细胞中减少。
图 5Spp1 KI Mye小鼠含有较少的包括甘油三酯（TGs）在内的饱和及单一不饱和脂肪酸
6. 在髓系SPP1过表达鼠中，ARG2的上调介导FA0增加
先前的研究表明，ARG2能够调节线粒体动力学并缓解肝脂肪变性，代谢组学分析显示，肉毒碱穿梭组分在SPP1KI中显著上调，且支持脂肪酸氧化和ATP水平也升高。线粒体染色显示SPP1过表达有更高的线粒体红色荧光和膜电位。为了检测FAO的改变，通过PA体外刺激肝细胞检测器耗氧率。SPP1KI的线粒体呼吸能力增加而siRNA敲除ARG2则受到了抑制。同时，作者构建了肝ARG2敲除鼠，发现敲除后加重了NASH表型
图 6在髓系SPP1过表达鼠中，ARG2的上调介导FA0增加
7. 髓系SPP1过表达和NASH模型导致MF转录组的性别特异性
为了解SPP1KI是不是影响了肝脏驻留的MF表型。分选肝巨噬进行转录组测序。通过雌雄不同条件鼠的差异基因进行IPA分析，发现不同NASH模型中雄性脂代谢，组织重塑通路富集，而雌性在炎症通路和脂代谢通路下调。因此作者认为SPP1具有性别特异性。随后作者通过筛选DEG与小鼠编码分泌蛋白的基因进行比对，得到16个Spp1介导的编码分泌蛋白的基因
图 7髓系SPP1过表达和NASH模型导致MF转录组的性别特异性
8. 髓系SPP1过表达驱动OSM的表达，而OSM又通过STAT3诱导ARG2
然后，提取IPA中的分子相互作用，构建了从编码分泌蛋白到Arg2的16个基因的预测调控网络。其中Oncostatin-M （OSM），THBS1，OPN连接性最高。而OSM差异性最高，并有可能通过STAT3，p38，MAPK和ERK调控SPP1表达。作者开展了体外实验验证其观点发现来自Spp1 KI Mye MFs的条件培养基可以诱导肝细胞ARG2及STAT3磷酸化，而这些变化在敲除OSM后消除。在MFs条件培养基+PA诱导条件下，OSM敲除的肝细胞具有更多的脂滴。在体内，作者发现给Spp1 KI Mye小鼠注射OSM中和抗体可以加剧NASH。
图 8髓系SPP1过表达驱动OSM的表达，而OSM又通过STAT3诱导ARG2
9. 髓系SPP1KI以性别特异性影响肝外FA代谢
在雄性鼠中，SPP1KI和WT有相似的体重增加和内脏脂肪积累程度，但SPP1KI上调了Pnpla2，该基因编码水解甘油三酯的酶。且体内脂肪分解发现其游离脂肪酸含量较少。而雌性鼠SPP1KI后，体重、内脏脂肪和脂肪细胞更小。并且胰岛素敏感性更高。因此SPP1不仅肝内有性别特异调控，肝外也有。且作用机制各不相同
图 9 髓系SPP1KI以性别特异性影响肝外FA代谢
总结：MFs衍生的OPN(骨桥蛋白)，可以上调OSM(抑瘤素M)，通过STAT3(转录激活因子3)诱导肝细胞内ARG2表达并式FAO增强，进而缓解NASH。
汇报人：张瑞芬
原文链接：DOI: 10.1053/j.gastro.2023.03.228