大家好!本周分享的文献是2025年1月发表在Advanced Science题为“Elevated SPARC Disrupts the Intestinal Barrier Integrity in Crohn’s Disease by Interacting with OTUD4 and Activating the MYD88/NF-κB Pathway”的文章，影响因子为14,1分。本研究探讨了 SPARC 在调节肠道屏障和 CD 进展中的作用及其潜在分子机制。观察到 SPARC 在 CD 患者和实验性结肠炎动物模型中表达较高，且与疾病进展呈正相关。还生成了 SPARC 敲除小鼠、细胞系和结肠类器官，证明 SPARC 的耗尽通过与 OTUD4 相互作用并抑制 MYD88/NF-κB/MLCK 通路，从而保持了肠道上皮屏障的完整性。

【研究背景】

克罗恩病（CD）是一类胃肠道炎症性疾病，其病因尚不明确。目前认为遗传因素、肠道菌群紊乱、肠道黏膜屏障缺陷、黏膜免疫调控异常等因素参与了疾病的发生和进展。 在这些因素中，受损的肠道黏膜屏障在 CD 的发病机制中起着关键作用。肠道黏膜屏障由一定厚度的细胞外黏液层、肠上皮细胞和紧密连接（TJ）组成，这些连接在维护肠道屏障完整性并抵抗微生物和外源抗原方面起着重要作用。肠道黏膜屏障的结构性和功能损伤进一步触发异常持续的免疫激活，并被认为与 CD 的起始和进展有关。在小鼠中，肠道黏膜屏障功能障碍或缺乏导致 CD 症状的发展或对实验性结肠炎敏感度增强。因此，深入探讨肠道屏障在 CD 发病机制中的作用，将为 CD 治疗提供新的靶点。分泌的酸性半胱氨酸富集蛋白（SPARC）是细胞外基质蛋白家族的一员，广泛表达于多种细胞类型、组织和器官中。SPARC 被认为参与了多种生物学功能，包括形态发生、组织重塑、细胞迁移和增殖。此外，SPARC 在炎症性肠病的发生和进展中也起着重要作用。例如，在活动性溃疡性结肠炎患者中，SPARC mRNA 水平和蛋白质表达上调，与组织学活性显著相关，使其成为肠道inflammation.SPARC敲除的潜在标志，通过影响肠道 Th17 细胞分化，显著缓解肠道敲除的2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导结肠炎小鼠肠道炎模型中的疾病进展。然而，SPARC 是否参与调节肠道屏障和 CD 尚未确定。

【研究结果】

1、SPARC 在 CD 患者和结肠炎模型⼩⿏中表达量较⾼

为探究SPARC是否参与调节肠道屏障和CD的发生发展，研究团队首先分析数据库中CD患者的黏膜样本,发现SPARC在CD组织中的表达显著高于正常组织。进一步研究显示,活动期CD患者的SPARC mRNA水平明显高于静息期患者。免疫组化分析证实,CD患者组织中SPARC蛋白水平显著升高,且与疾病严重程度呈正相关。在动物模型层面,研究者构建了DSS和TNBS诱导的结肠炎小鼠模型,免疫组化和Western blot分析均显示,实验组小鼠结肠组织中SPARC表达显著增加,证实了SPARC在炎症性肠病中的重要作用。

Fig1. CD 患者和结肠炎⼩⿏肠道黏膜中 SPARC 表达升⾼ 

2、SPARC 敲除⽅法缓解实验性结肠炎⼩⿏的炎症

为系统验证SPARC在CD中的功能,研究团队构建了全身SPARC敲除小鼠。与野生型小鼠相比,SPARC敲除小鼠在DSS刺激下体重下降幅度减小、疾病活动指数(DAI)更低、结肠长度缩短程度减轻。组织学检查显示,SPARC敲除小鼠DSS诱导的结肠炎症显著减轻，组织学评分明显改善。此外,SPARC敲除小鼠结肠组织中中性粒细胞浸润标志物MPO活性显著降低,促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β的表达也明显减少。且在慢性DSS结肠炎和TNBS诱导的结肠炎模型中观察到一致的保护效应，这些结果证实SPARC在实验性结肠炎中发挥促炎作用。

Fig2. SPARC 敲除能抵抗 DSS 和 TNBS 诱发的结肠炎

3、SPARC 的下调可保持肠道上⽪细胞的完整性

为深入探讨SPARC在结肠炎进展中的潜在机制,研究团队对DSS刺激的野生型和SPARC敲除小鼠肠道上皮组织进行蛋白质组学分析。KEGG通路分析显示,差异蛋白主要富集在肌动蛋白细胞骨架调节、焦点粘附和细胞粘附过程等与肠道屏障密切相关的通路中。透射电镜分析显示,与DSS处理的野生型小鼠相比,SPARC敲除小鼠的微绒毛更长更多,细胞内连接复合体损伤更轻,胞间间隙扩张减少。免疫荧光和Western blot检测发现,SPARC敲除小鼠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平更高。功能检测显示,SPARC敲除小鼠的肠道通透性明显降低。为进一步研究SPARC在肠上皮细胞中的作用，作者建立了WT和SPARC KO小鼠结肠类器官模型。SPARC敲除小鼠来源的类器官克隆形成更快，在TNF-α处理后形态保持更完整，FD4通透性显著低于WT组，紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达增强。同时在Caco-2细胞模型也得到类似结果，进一步证实了SPARC在调节肠道屏障功能中的重要作用。

Fig3. 抑制 SPARC 表达可改善炎症环境中肠道上⽪屏障的完整性

4、SPARC 直接与 OTUD4 结合

为阐明SPARC调节肠道上皮屏障的分子机制,研究团队通过LC-MS/MS和蛋白质组学分析鉴定了SPARC的潜在蛋白相互作用伙伴。在这些相互作用蛋白中,重点关注了几个泛素相关蛋白,包括OTUD4、USP10、TRIM21和TRIM71。鉴于OTUD4作为重要的去泛素化酶在CD进展中发挥关键作用,研究团队选择OTUD4作为候选蛋白进行深入研究。Co-IP实验证实了SPARC与OTUD4之间的直接相互作用,免疫荧光显示两者在细胞质中共定位。通过构建一系列截断片段,研究者发现SPARC的D1结构域(aa 18-70)是与OTUD4结合所必需的,而OTUD4的N端结构域(aa 1-155)在结合SPARC中发挥重要作用。

Fig4. SPARC 与 OTUD4 直接结合

5. SPARC 通过 MYD88/NF-κB/MLCK/MLC2 通路破坏肠道上⽪屏障

研究发现,SPARC可以与OTUD4竞争性结合MYD88,阻止OTUD4对MYD88的去泛素化作用,从而激活MYD88依赖的信号转导。SPARC过表达显著降低了OTUD4对MYD88 K63连接多聚泛素的去泛素化效果,促进了NF-κB p65从细胞质向细胞核的转位。进一步研究显示，SPARC通过激活MYD88/NF-κB信号通路上调MLCK表达，激活MLCK/MLC2通路,导致肌动蛋白细胞骨架重排，最终破坏紧密连接蛋白的完整性。重要的是，MLCK抑制剂Peptide18的使用可以逆转SPARC过表达对ZO-1和Occludin表达的抑制作用，证实了该信号通路的重要性。

Fig5. SPARC 通过 MYD88/NF-κB/MLCK 通路损伤肠道上⽪屏障

6. M6A 甲基化介导 CD 中 SPARC 的上调

为探讨CD中SPARC高表达的机制,研究团队检查了SPARC mRNA的m6A甲基化变化。结果显示,SPARC mRNA存在显著的m6A修饰,这种修饰由甲基转移酶METTL3介导。m6A阅读蛋白YTHDF1与SPARC mRNA直接相互作用,调节其翻译过程。免疫组化分析显示,CD患者组织中METTL3和YTHDF1蛋白水平显著升高,且与SPARC表达呈正相关。功能实验证实,METTL3抑制剂STM2457可降低SPARC蛋白表达,而YTHDF1过表达则增加SPARC蛋白表达,但均不影响SPARC的mRNA水平,表明YTHDF1介导的m6A甲基化主要调节SPARC mRNA的翻译效率。

Fig6. YTHDF1 以 m6A 依赖性⽅式促进 SPARC 表达

Fig7. SPARC 调节 CD 肠道屏障的机制

【研究结论】

1、SPARC 在克罗恩病中异常升高，通过与 OTUD4 竞争性结合，激活 MYD88 / NF-κB / MLCK / MLC2 信号通路，导致肠上皮紧密连接破坏和屏障功能障碍。

2、SPARC高表达受 METTL3–YTHDF1 介导的 m⁶A 修饰调控。

3、SPARC 及其相关信号轴可能成为 CD 的潜在治疗靶点。 

DOI号：10.1002/advs.202409419

                                                              汇报人：郭洋