大家好！为大家介绍一篇2021年发表在Journal of Hepatology杂志上的文章，题目为“Hepatocyte pyroptosis and release of inflammasome particles induce stellate cell activation and liver fibrosis”。文章验证了肝细胞NLRP3过度激活导致肝细胞焦亡和炎性体复合物分泌到细胞外空间。发现细胞外炎性体颗粒可以被肝星状细胞内化，导致其细胞活化并且介导炎症和促纤维化应激信号。Caspase-1激活存在于NASH患者的肝脏中，可以在这些患者的血清中监测到与肝损伤严重程度，特别是与纤维化阶段相关的Caspase-1激活。
【背景介绍】
肝细胞损伤是多种急性和慢性肝脏疾病中炎症和疾病进展的中心机制。 最近的证据表明焦亡在肝脏疾病中起重要作用。焦亡依赖于炎性小体介导的caspase-1激活，由于气皮蛋白D （GSDMD）插入导致质膜孔形成，导致细胞内蛋白释放、离子失代偿、水内流和细胞肿胀。炎性小体是细胞质多蛋白复合物，通常由炎性小体传感器分子如NLRP、接头蛋白ASC和效应分子pro-caspase-1组成。刺激后，NLRP3与ASC结合并构建炎性小体复合物，导致caspase-1激活且随后蛋白水解激活促炎细胞因子IL-1β和IL-18，以及胞质蛋白GSDMD。最近的研究发现，在巨噬细胞焦亡过程中，由NLRP3和ASC组成的炎性小体低聚物被释放到细胞外空间，在那里它们可以被邻近的巨噬细胞吞噬。炎性小体激活和焦亡在非髓细胞中的作用以及它们是否对无菌和感染性应激源有反应尚不清楚。肝细胞是否发生热噬细胞死亡及其在体内肝损伤和纤维化发展中的潜在作用是一个尚未解决的核心问题。
我们课题组和其他人之前的研究已经报道了NLRP3炎性体激活在肝脏疾病的发生和进展中的关键作用。由于肝脏是一个“第一关”器官，不断受到来自肠道的各种微生物颗粒和内源性代谢应激信号的挑战，我们假设肝细胞能够经历NLRP3介导的热噬细胞死亡，并将细胞外NLRP3炎性体复合物释放到细胞外空间。我们还假设细胞外炎性体可以被肝星状细胞内化，导致其活化和肝纤维化。
【研究结果】
为了验证肝细胞能够经历热噬细胞死亡的假设，我们首先进行了体外研究，用LPS加PA或Nig作为额外的第二信号刺激分离的原代小鼠肝细胞、人肝细胞和HepG2细胞。两种处理都导致原代小鼠肝细胞（图1A-B）和人肝细胞（图2A）中活性caspase-1-和pi阳性细胞的数量显著增加。LPS + Nig和LPS + PA联合使用增加了原代小鼠肝细胞（图1C）中LDH的释放。阻断caspase-1活性完全消除了人肝细胞中LDH的释放（图1）和焦亡细胞的死亡（图2A-B）。我们进一步发现，增加的caspase-1激活依赖于NLRP3炎性体的组装和激活，因为NLRP3抑制剂MCC950消除了HepG2细胞中的caspase-1激活（图S2）。GSDMD在HepG2细胞中的KD或对GSDMDKO 小鼠分离的原代肝细胞的研究显示出对炎症小体诱导的热噬细胞死亡的抵抗（图1G-H），表明肝细胞的死亡依赖于GSDMD的激活。
接下来，我们研究了肝细胞的焦亡过程是否与NLRP3低聚物和其他炎性体成分的释放有关。LPS + Nig或LPS + PA处理的细胞分别释放43.1%和32.4%的ASC-YFP斑点（图1D）。免疫印迹分析还显示，肝细胞释放NLRP3炎性体成分，如NLRP3、ASC、前caspase-1、前IL-1β，以及成熟的IL-1β和裂解的caspase-1 （p20）到细胞外空间（图1E、F和2C、D）。此外，原代人肝细胞热噬细胞死亡增加与NLRP3和IL1b mRNA表达增加相关（图2B）。
图1 NLRP3炎性小体激活后肝细胞发生热亡
图2 原代人肝细胞经历热噬细胞死亡并释放活化的炎性小体蛋白和IL-1β
我们在NASH、脂肪变性和正常对照患者的冷冻肝脏切片中寻找caspase-1激活的存在，发现与正常对照相比，NASH肝脏中caspase-1激活增加（图3A）。接下来，在154例活检证实的NAFLD患者中，对血清caspase-1活性进行了评估（表S3）。大约三分之一（n = 63,29.7%）患有NASH。血清caspase-1活性在肝细胞球囊、炎症和纤维化存在时显著升高，但没有脂肪变性，表明肝损伤的特异性（图3B-E）。
图3 NASH患者肝脏和血清中Caspase-1活性升高，并与肝损伤严重程度相关
为了在体内研究肝细胞焦亡与肝损伤的机制相关性，我们制造了肝细胞特异性Nlrp3KI的CreA小鼠。最初，我们检查了从这些小鼠中分离的肝细胞的体外焦亡的发生。从Nlrp3KICreA小鼠分离的肝细胞显示caspase-1/PI双阳性细胞比从WT小鼠分离的肝细胞高5倍，表明细胞热亡（图4A-B）。接下来，我们评估了肝细胞焦亡在体内的潜在影响。Nlrp3KICreA小鼠维持正常饮食6个月和9个月。我们发现Nlrp3KICreA小鼠的肝脏中tunel阳性细胞在9个月时增加（与WT相比为1.2倍，p <0.05）（图4C），表明Nlrp3KICreA小鼠的肝细胞死亡。肝脏基因表达分析显示，9月龄时，Nlrp3KICreA小鼠的纤维化标记基因（Timp1: 3.4倍于WT，纤连蛋白1:1.8倍于WT， p <0.05）和星状细胞激活上调（图4F）。这与天狼星红染色测定的Nlrp3KICreA小鼠肝脏胶原沉积增加（与WT相比增加1.8倍，p <0.05）（图4D）以及α-SMA蛋白表达增加（与WT相比增加1.5倍，p <0.05）（图4E）一致。这些发现揭示了肝细胞NLRP3活化、焦亡和肝纤维化之间的新联系。
图4 肝细胞特异性Nlrp3突变小鼠（L351P Nlrp3 KI CreA）显示肝细胞caspase-1激活增加，纤维化增加
由于NLRP3在肝细胞内的内源性表达水平很低，我们给CreA小鼠注射了LPS (4 h)，以增加NLRP3的表达，并加重我们的肝细胞特异性转基因小鼠的作用。肝脏免疫组织学显示，与LPS处理的WT小鼠相比，Nlrp3KICreA小鼠的白细胞浸润（图5A），tunel阳性细胞（图5B）以及F4/80和cd11b阳性细胞（图5C-D）增加。我们还测量了与WT小鼠相比，lps注射Nlrp3KICreA小鼠肝脏中GSDMD激活增加（图5E）。这些数据表明，在LPS启动后，Nlrp3肝细胞特异性Nlrp3KICreA小鼠更容易发生肝细胞死亡和炎症。
图5 肝细胞特异性Nlrp3突变小鼠更容易发生lps诱导的肝脏炎症和肝细胞死亡
Nlrp3KICreA小鼠肝脏中自发发生HSC活化、纤维化发生和早期纤维化改变的发现，以及循环caspase-1活性与NASH患者肝纤维化之间的强相关性，促使我们研究这一过程中涉及的潜在机制。我们设计了实验来验证肝细胞在焦亡过程中释放的NLRP3炎性体颗粒可以被HSC内化并调节其表型的假设。YFP荧光标记的NLRP3是从NLRP3突变的HEK细胞系中分离出来的，该细胞系携带与我们的肝细胞特异性NLRP3KICreA小鼠相同的NLRP3基因突变（L351P），导致NLRP3在这些细胞中自发寡聚化和激活。通过共聚焦显微镜（图6A）和与NLRP3-YFP炎症小体低聚物孵育后的LX2裂解物的免疫印迹分析（图6B）证实了细胞外NLRP3-YFP炎症小体的内化。此外，摄取细胞外NLRP3- yfp炎性小体寡聚物诱导hsc分泌IL-1β，这表明内化的NLRP3炎性小体能够促进靶细胞分泌IL-1β（图6C）。Calcein-AM和F-actin染色显示LX2细胞（图6D）和原代人肝星状细胞（图6E）摄取NLRP3-YFP寡聚物，并表明细胞形态向肌成纤维样细胞反分化方向变化。免疫荧光染色显示，与无血清培养基处理的LX2细胞相比，α-SMA mRNA和蛋白表达增加（6倍，p <0.01）（图6G）。星状细胞的激活依赖于NLRP3-YFP寡聚物的摄取，与细胞松弛素B（一种内吞抑制剂）共同刺激研究，阻断了LX2细胞中α-SMA的表达和蛋白水平（图6F-H）。在细胞外NLRP3-YFP寡聚物处理后，抑制caspase-1也能够降低LX2细胞中ACTA2的表达（图6F）。为了验证热噬肝细胞的上清是否也会导致星状细胞活化，我们用LPS + Nig刺激ASC-YFP转染的HepG2细胞，并将上清转移到肝星状细胞中。LX2细胞与焦亡肝细胞上清孵卵后的基因表达分析显示，星状细胞活化标记基因（ACTA2, COL1A1, TIMP1）和IL1b表达增加（图6J）。这些结果表明，肝星状体中内化的细胞外NLRP3炎性小体低聚物可导致细胞活化。
图6 肝星状细胞内化细胞外NLRP3/ASC炎性体斑点，导致其活化
【总结】
本研究的主要发现描述了肝细胞焦亡和细胞外炎性体的存在及其意义。我们的研究结果确定了NLRP3炎性小体激活过程中原代人肝细胞的热亡细胞死亡和炎性小体蛋白的释放。我们发现细胞外炎性体颗粒可以被肝星状细胞内化，导致其细胞活化。此外，NASH患者的肝脏和血清caspase-1活性显著升高，但脂肪变性患者没有。总之，我们的数据表明，肝细胞NLRP3过度激活导致肝细胞焦亡和炎性体复合物分泌到细胞外空间。Caspase-1激活存在于NASH患者的肝脏中，可以在这些患者的血清中监测到与肝损伤严重程度，特别是与纤维化阶段相关的Caspase-1激活。这些新描述的细胞外NLRP3炎性体复合物的促纤维化作用鉴定了肝细胞释放的过多的热噬应激信号，并支持了旨在调节细胞外NLRP3治疗慢性肝病的新治疗策略的潜力。
DOI:https://doi.org/10.1016/j.jhep.2020.07.041
汇报人：吴娉婷