为大家介绍一篇于2025年发表在 Nature（IF=48.5）的文章，题目为“Genome-wide CRISPR screen in human  T cells reveals regulators of FOXP3”的研究论文。

【背景介绍】

  调节性 T 细胞是一种特殊类型的 T 细胞，占 CD4+T 细胞的 5-7%左右。调节性 T 细胞可以被抗原呈递细胞呈递的抗原特异性的激活，一旦被激活，调节性 T 细胞就会发挥旁观者抑制作用，通过各种直接或者间接的方式抑制效应 T 细胞。并且调节性 T 细胞可以通过一种称为感染耐受的现象将其抑制特性传播到临近的细胞。

  调节性 T 细胞（Treg 细胞）是适应性免疫系统的一个重要组成部分，负责维持免疫自耐受。调节性 T 细胞被破坏会导致自身免疫相关的病理损伤，与之相反，通过增强调节性 T 细胞功能和稳定性为治疗自身免疫相关的疾病提供了一个新的途径。Treg细胞特异性表达主转录因子 FOXP3，在维持免疫耐受和稳态方面发挥关键作用。右图展示的是 FOXP3 基因的编码和非编码元件，以及一些根据报道具有激活基因转录或者是具有相互作用的转录因子。

  目前，体外诱导调节性 T 细胞表达 FOXP3，主要通过 TGFβ和 IL-2 刺激原始的 CD4+ T 细胞来诱导调节性 T 细胞中表达 FOXP3，但这些结果往往不够稳定，从而阻碍了进一步的转化应用。因此，作者希望通过使用 CRISPR 筛选的方法去寻找 FOXP3 的调控因子。

【研究结果】

1. CRISPR 筛选用于识别 FOXP3 的调控因子

  作者在原有的 Cas9 CRISPR 筛选技术的基础上进行了拓展，在将 Cas9 蛋白通过电穿孔的方式导入 naïve CD4+ T 细胞之后对细胞进行了扩增，扩增之后通过添加 TCR 激活以及外源的 TGFβ和 IL-2 诱导 FOXP3 的表达。在诱导 72 小时之后收集并染色细胞，然后根据内源性的 FOXP3 表达对诱导调节性 T 细胞进行流式分选，将诱导调节性 T 细胞分类为 FOXP3 高低表达组，然后通过二代测序检测 sgRNA 读数并进行后续的分析（图 1A）。

  通过对测序数据中 sgRNA 富集情况的分析，作者发现了很多 FOXP3 相关的调控因子。其中负调节因子用红色表示，正调节因子用蓝色表示。这些调节因子当中有一些是已知的，也有一些是新发现的。（已知的调节因子例如：TGFBR1、SMAD3/4、UHRF1 和 FOXP3 本身。新的调控因子：如 SMARCB1、MIDN 和 SIK3 等）。C 图展示了一些 sgRNA 在的富集分布情况，红色表示在高表达 FOXP3 的细胞中富集，蓝色表示在低表达 FOXP3 细胞中富集。

通过对负向 FOXP3 调控因子进行 GO 分析，发现 Notch 细胞内结构域转录调控相关成员显著富集（包括 RBPJ、HDAC3、GPS2、TBL1XR1 和 NCOR1/2），同时也富集了涉及 T 细胞激活和泛素 E3 连接酶的通路（图 1d）。在 FOXP3 的正向调控因子中，则可以观察到参与染色质组织、组蛋白修饰的基因富集（图 1d）

  为了进一步的验证使用 CRISPR screening 筛选出来的首要靶点，作者通过使用 Cas9-gRNA 核糖核蛋白进行单个基因敲除来验证筛选出的首要靶点。单敲的结果观察到的趋势通常与筛选的结果一致。

同时，作者通过统计 FOXP3 表达的中位数荧光强度和表达 FOXP3 的细胞百分比，来表征 FOXP3 的表达以及调节 T 细胞的诱导效率。用来识别调节因子对 FOXP3 的调节是通过提高 FOXP3 蛋白本身的表达还是通过提高调节 T 细胞的诱导效率。

  例如：DNMT1 和 CUL3 可以提高 FOXP3 蛋白的表达，但是不能提高调节 T 细胞的诱导效率。而 RBPJ 和 SIK3 可以同时提高 FOXP3 蛋白的表达和调节 T 细胞的诱导效率。同样，对于 FOXP3 正向调节因子 DHX36，尽管诱导调节性 T 细胞的效率和非靶向对照组相同，但是 DHX36 的耗竭降低了 FOXP3 蛋白的表达，作者认为这可能反映了 DHX36 在介导翻译输出中的转录后调控功能（图 1g）。

2. 使用 icCITE-seq 进行扰动分析

  为了无偏地评估每个假定的 FOXP3 调节因子受到扰动后引起的整体转录组变化和特定蛋白质变化，作者整合了 CRSPER 筛选和 icCITE-seq 的技术，创建了一个叫 Perturb-icCITE-seq 的技术。通过使用 Perturb-icCITE-seq 技术，可以得到在敲除特定的靶基因之后，细胞内的 mRNA 和特定蛋白质表达水平的变化。作者在正在向诱导调节性 T 细胞极化的人原代 T 细胞中进行了 Perturb-icCITE-seq 分析。该分析针对全基因组筛选中得到的 295 个候选命中基因和对照，同时对 300 多种不同的细胞表面和胞内抗原表位进行了分析。分析发现，敲除 FOXP3 基因后，细胞内 FOXP3 蛋白信号随之降低；而敲除 RBPJ、SIK3 和 ZBTB7B 基因则使该信号升高（图 2b）。对于其他目标基因，如 IKZF3 也呈现出类似趋势（图 2b 和扩展数据图 2a）这验证了对这些胞内蛋白质进行抗原表位特异性分析的可行性。此外，作者发现目标基因敲除后 FOXP3 蛋白表达水平与 CRISPR 筛选中相应 gRNA 的富集程度高度一致（r = -0.71；图 2c）。

3. 协同功能模块与基因程序

  接下来，作者对单个基因的敲除在转录组图谱上产生的影响进行建模。由此得到的调控模型将 227 个目标敲除基因与 2192 个发生显著变化的基因联系起来，这些基因可进一步聚类为 11 个共功能目标基因模块和 10 个基因共调控程序。相同的模块通常具有相同的表达模式，例如，当模块 A 中的基因受到敲除之后，这 2192 个收调控的基因的表达模型都是非常相似的。而同一个调控模块和其他调控模块之间的关系也是基本一致的，例如模块 A 和模块 B 呈现一个负相关的状态，而和模块 C 到 E 更偏向于正相关。受调控的基因程序也是类似的，同一个基因程序的表达和受到的调控是类似的。在这个分析当中，模型正确的将一些已知的基因模块和信号通路划分到了相同的模块当中（分别为模块 F 和模块 J；扩展数据图 2g）。例如：模块 F 的 CD3D，CD3E 和 LCP2 是已知的影响 T 细胞受体的基因，模块 J 的 TGFBR1，SMAD3，SMAD4 和 TGFBR2 是已知的影响 TGFβ信号通路的基因。这些结果都说明了作者构建的模型的准确性。

  之后，作者对单个的模块以及基因程序进行了展示和说明。对单个基因程序的解析，可以明确靶向的基因模块与特定细胞过程之间的调控相互作用关系。在模块 I 中，其成员仅包含与 NCOR 转录抑制复合物（GPS2、HDAC3、NCOR1 和 TBL1XR1）相关的基因，在最初的全基因组筛选中，这些基因被确定为 FOXP3 表达的负调节因子（图 1b、e）。可以看到，在模块 I 相关的基因被靶向敲除之后，FOXP3 所在的基因程序 5 相关的基因会上调（两者的连线是代表激活的红色）。尽管已知 RBPJ 与该复合物存在相互作用，但是，它并未包含在这个模块中，而是与模块 H 相关联。对这些因子的调控图谱进行比较分析，Jaccard 指数越高，表示两个基因的调控模型越相近。分析发现与 NCOR 复合物的其他成分相比，敲除 RBPJ 会诱导出某种不同的转录特征（扩展数据图 3d）。这些结果很可能表明，RBPJ 仅占 NCOR 抑制功能的一部分。

  接下来，作者通过研究被敲除的目标基因之间相互的转录影响，探究了这些受扰动目标基因之间潜在的调控关系。在左边的网络图中，箭头的方向代表调控的方向，红色的箭头代表正向调控，蓝色的箭头代表负向的调控。从网络图中可以看出，有很多的基因都对 RBPJ 存在调控相互作用，而对网络进行一个特征向量中心性的计算也可以发现，RBPJ 的中心性是最高的。RBPJ 基因的高中心性说明在这个调控网络当中，RBPJ 是一个核心枢纽，在诱导调节性 T 细胞中受到各种信号线索的紧密调控。（扩展数据图 3e、f）

  为了进一步了解敲除 RBPJ 所产生的转录效应，作者将敲除了 RBPj 的 FOXP3 阳性的诱导调节性 T 细胞和 FOXP3 阳性的非靶向对照进行了比较。分析显示，RBPJ 基因敲除的诱导调节性 T 细胞（iTreg 细胞）表达更高水平的调节性 T 细胞（Treg）功能核心效应基因，如 FOXP3、IL2RA 和 ENTPD1（图 2f）。此外，对差异蛋白质表达进行分析发现，CD39、Tim-3 和 CTLA4 的表达水平更高，这表明敲除 RBPJ 可能会增强诱导调节性 T 细胞（iTreg）的抑制活性（扩展数据图 3g）。

  综合上面的所有的数据和分析，显示了作者的 Perturb-icCITE-seq 技术在针对胞内蛋白质的大规模 CRISPR 筛选中进行可扩展的、系统性验证的能力。

  上面的这些分析将 RBPJ 鉴定为 FOXP3 表达的一种新型抑制因子。接下来就开始围绕这个分子做更深入的和更详细的分析。

4. RBPJ 是 FOXP3 的负向调节因子

  RBPJ 是一种众所周知的主要下游转录激活因子，通过与 Notch 细胞内结构域（NICD）和 MAML1 - 3 结合，调控 Notch 信号响应基因的表达 。然而，在没有活跃的 Notch 信号传导时，RBPJ 会与 NCOR1/2 ， HDAC3 等 一起形成共抑制复合物，以介导转录抑制。前面的全基因组筛选中，RBPJ 共抑制复合物显著富集，但是也不能排除因为筛选灵敏度问题而遗漏的经典 Notch 信号通路的潜在贡献（图 3a）。因此，作者对 Notch 信号通路进行敲除来排除 Notch 信号通路的影响。与最初的筛选结果一致，单独针对 Notch 通路相关的基因进行敲除没有导致 FOXP3 蛋白表达的显著变化（图 3b 和扩展数据图 4h，i），这排除了 Notch 信号通路的影响。并且，天然调节性 T 细胞（nTreg）中敲除 RBPJ，FOXP3 的表达和对照组没有显著的差异，这也和之前的报道是一致的。

  作者的 CRISPR 筛选实验需要 T 细胞受体（TCR）预刺激，所以作者想要排除可能因多轮 TCR 激活而产生的潜在混杂效应。

为此，作者使用 RBPJ 靶向反义寡核苷酸（ASO）处理了刚分离的 naive CD4+ T 细胞，使其发生诱导调节性 T 细胞极化（iTreg）。可以观察到在针对 RBPJ 的 ASOs 中 FOXP3 表达的细胞比例（图3c）以及 FOXP3 的表达量高于都非靶向对照（NTCs），这证实了这些效应并不依赖于 TCR 预先刺激（图 3c 和扩展数据图 4k–m）。

此外，对非靶向对照细胞（NTC）与 RBPJ 敲除静息 T 细胞中差异表达基因的分析显示，未富集在全基因组 CRISPR 筛选中鉴定出的 FOXP3 调节因子（扩展数据图 4n），这排除了在静息 T 细胞中敲除 RBPj 所带来的影响，证明了 RBPJ 敲除的对于 FOXP3 调控是具有条件依赖性的。综合来看，这些数据都显示了 RBPJ 在直接调控 FOXP3 表达中的作用。

  上面的分析是在单细胞水平上进行的，接下来，作者希望在 RNA-seq 的整体水平上比较 RBPJ 耗竭和非靶向对照的诱导调节性 T 细胞（iTreg）之间的全局基因表达来验证单细胞数据的结果。为了减轻由于 RBPJ 缺失的诱导调节性 T 细胞中 FOXP3+细胞比例增加而引起的潜在混淆效应，作者开发了细胞内 RNA 测序（icRNA-seq），这个技术通过流式细胞术分离出高纯度的 FOXP3 表达细胞进行分析（扩展数据图 5a–d）。RNA-seq 测序分析发现，RBPJ 缺失在 FOXP3⁺诱导调节性 T 细胞（iTreg）中引发了广泛的转录组变化，包括 FOXP3 的 mRNA 表达增加，以及 RBPJ 和 SGK1 的表达降低（图 3d，e）。

总体来说，胞内 RNA-seq 的分析结果与作者之前的单细胞分析结果一致（扩展数据图 5e）。可以观察到调节性 T 细胞（Treg）谱系核心基因（如 IL2RA 和 ENTPD1）的 RNA 表达增加，同时还额外鉴定出了 ICOS、TIGIT、HAVCR2（编码 Tim-3）和 LRRC32 等基因（图 3d，e）。基因集富集分析（GSEA）表明，在 RBPJ 敲除的诱导调节性 T 细胞（iTreg）中，“调节性 T 细胞（Treg）样” 转录组特征上调（图 3f 和扩展数据图 5f），这表明 RBPJ 的扰动可能赋予诱导调节性 T 细胞（iTreg）更接近于调节性 T 细胞（Treg）的转录特性。

  基于这些发现，作者假设对 RBPJ 的调节可能会进一步增强诱导调节性 T 细胞（iTreg）的功能。

5. RBPJ 缺失提高了诱导性调节性 T 细胞（iTreg）的功能

  因为在上述的分析中，作者假设对 RBPJ 的调节可能会进一步增强诱导调节性 T 细胞（iTreg）的功能。因此接下来作者就研究了 RBPJ 的缺失对于诱导调节性 T 细胞功能的影响。此前研究表明，位于 Foxp3 基因的 CNS（保守非编码序列）顺式调控区域在 FOXP3 表达的调节中起着关键作用。特别是调节性 T 细胞（Treg）特异性的去甲基化增强子区域 CNS2，它与 FOXP3 的稳定性密切相关。尽管有各种方法通过调节 TCR 共刺激或 DNA 甲基转移酶相关酶活性来有效地在小鼠中诱导调节性 T 细胞类型的 CNS2 去甲基化，但到目前为止，这些方法对人的诱导调节性 T 细胞细胞并不适用。

因此，作者探究敲除 RBPJ 的诱导调节性 T 细胞（iTreg）在 CNS2 处是否也会出现 DNA 甲基化变化。

和先前研究一致，非靶向对照（NTC）诱导调节性 T 细胞（iTreg）仅表现出适度的 CNS2 CpG 去甲基化（图 3g 和扩展数据图 6a）。与之相反，作者发现诱导调节性 T 细胞（iTreg）中 RBPJ 缺失后，CpG 甲基化的丢失始终增加，且这种增加依赖于抗坏血酸的添加，这表明受扰动的细胞相较于非靶向对照（NTC）细胞，在 CNS2 处出现了更高的从头去甲基化。因为 FOXP3 基因座处的 CNS2 去甲基化能够保护调节性 T 细胞（Treg）中 FOXP3 的表达免受促炎信号分子的抑制作用。作者推断在敲除 RBPJ 的诱导调节性 T 细胞（iTreg）中观察到的去甲基化增加，可能会增强 FOXP3 表达对长时间暴露于炎性细胞因子的抵抗力。作者通过实验验证敲除 RBPJ 的调节性 T 细胞对于炎性细胞因子的抵抗力，和预期的一样，敲除 RBPJ 的诱导调节性 T 细胞（iTreg）的 FOXP3 表达量更高，并且在炎性细胞因子存在的情况下也更加稳定。在第七天和第十四天的时候，FOXP3 蛋白的表达量显著高于对照组，并且 FOXP3 阳性 T 细胞的比例也显著的高于对照组。

  这部分分析说明了 RBPJ 的敲除可以促进 FOXP3 基因的 CNS2 区域的去甲基化，并且增加 FOXP3 的表达以及稳定性。

  接下来作者进一步在转基因小鼠的 T 细胞中验证 RBPJ 诱导的 FOXP3 蛋白表达的稳定性。图 d 和图 e 分别展示了对于转基因的小鼠细胞来说，RBPJ 的敲除对于新生成的诱导调节性 T 细胞（图 d）和已经分化的 FOXP3 阳性的诱导调节性 T 细胞的稳定性的影响。可以发现 RBPJ 的敲除显著的提升了 FOXP3 的稳定性，这个结果和在人类细胞中研究的结果一致。因为敲除 RBPJ 的诱导调节性 T 细胞（iTreg）中 FOXP3 的表达和稳定性增加，并且 CTLA4 和 CD25 等功能效应基因的表达升高（图 2f 和扩展数据图 3g、6f、g），作者假设这些细胞可能具有更强的抑制功能。因此做了一个细胞分裂的抑制实验来说明 RBPJ 可以增强调节 T 细胞的抑制功能，同样的，实验结果表明敲除 RBPJ 之后的诱导调节性 T 细胞具有更强的抑制活性，CD4 阳性 T 细胞和 CD8 阳性 T 细胞的增值比例显著的降低。

6. RBPJ 通过 NCOR 调控 FOXP3

  在确定了 RBPJ 的缺失可以提高诱导调节性 T 细胞的功能之后，作者希望确定抑制 FOXP3 所需的 RBPJ 关键结构域。

因此作者使用了 151 种不同的靶向 RBPJ 基因座外显子编码区域的 sgRNA 进行了高密度诱变。在这个实验系统中，FOXP3 高表达细胞中 sgRNA 富集增加，也可能表明在功能残基中发生框内突变的可能性增加，从而导致功能丧失的结果。

当靶向编码 BTD（β- 三叶形 DNA 结合结构域）和 CTD （C 末端结构域）的序列时，可以观察到富集分数增加，这两个结构域都已被证明在介导 RBPJ 与 SMRT-NCOR 抑制复合物之间的相互作用界面中起着关键作用 [49]（图 4a、扩展数据图 7a 和补充表 4）。

与对这些结构域的依赖性一致，与 SMRT-NCOR 相互作用缺陷的 RBPJ 突变体 （突变体 F235A/L362A，以下称为突变型 RBPJ）在很大程度上逆转了 RBPJ 转导的 CD4+ T 细胞进行诱导调节性 T 细胞极化时出现的严重 FOXP3 诱导缺陷（图 4b）。

这部分的分析证明了 RBPJ 调控 FOXP3 的关键结构域在 BTD 和 CTD 部分，并且是与 SMRT-NCOR 抑制复合物之间的相互作用界面。

  作者假设，在诱导调节性 T 细胞（iTreg）分化过程中，RBPJ 可能通过直接调节 FOXP3 基因座来发挥其作用。因此，作者使用包含 RBPJ 共有基序（ TTTCCCAC ）的 DNA 探针以及来自正在进行诱导调节性 T 细胞（iTreg）极化的人 CD4⁺ T 细胞的核提取物，通过 EMSA（电泳迁移率变动分析）来评估 RBPJ 与 FOXP3 转录起始位点（TSS）的结合情况。EMSA 显示，RBPJ 直接结合在这些细胞的 FOXP3 启动子上，这支持了直接转录调控的观点（扩展数据图 7d）。

为了评估这种结合的功能相关性，作者克隆了 FOXP3 启动子区域用于荧光素酶测定，并评估了诱导调节性 T 细胞（iTreg）中的启动子活性。作者发现，当 RBPJ 共有基序被破坏时，荧光素酶表达大幅增加，而在 RBPJ 过表达时，基础表达水平下降（图 4c）。

这部分的分析也进一步说明了 RBPJ 对于 FOXP3 的调控是一种直接调控，通过作用于 FOXP3 的启动子区域来影响 FOXP3 的表达。尽管作者的研究阐明了敲除 RBPJ 在 FOXP3 调节中的作用，但之前的全基因组筛选和验证实验表明，以 RBPJ 为中心的 NCOR 抑制复合物也协同参与其中。此外，之前的 RBPJ 转导实验表明，这种物理相互作用对于介导依赖于 RBPJ 的 FOXP3 抑制至关重要（图 4b）。因此，作者对该复合物的机制作用进行表征。

  具体来说，作者关注 HDAC3 的作用，它是 NCOR 共抑制复合物的核心催化成分，也是前面全基因组筛选和验证实验中的一个重要发现。和预期的那样，相互作用缺陷的突变型 RBPJ 消除了 RBPJ 与 HDAC3 相互作用的能力（图 4d）。

并且，在 HDAC3 的敲除可以挽救由于 RBPJ 过表达导致的诱导调节性 T 细胞分化的缺陷，而在 RBPJ 突变型的细胞中则没有显著影响。这部分的分析表面，HDAC3 通过和 RBPJ 相互作用直接参与了 FOXP3 的调节。

7. RBPJ–HDAC3 介导的组蛋白去乙酰化

  因为 HDAC3 具有组蛋白去乙酰化功能，并且在基因抑制中发挥着重要作用。因此作者探究了 RBPJ 的缺失是否会改变 FOXP3 基因座处的局部组蛋白乙酰化水平。为此，作者对 RBPJ 缺失的诱导调节性 T 细胞（iTreg）和非靶向对照（NTC）诱导调节性 T 细胞（iTreg）中的 H3ac、H3K9ac 和 H3K27ac 进行了 ChIP-seq 分析。与在 RBPJ 缺失的诱导调节性 T 细胞（iTreg）中观察到的较高 FOXP3 表达一致，作者发现这些细胞在整个 FOXP3 基因座上的 H3ac 和 H3K9ac 水平也有所升高，这暗示 RBPJ 可能通过招募 HDAC3 在调节这些组蛋白修饰中发挥潜在作用（图 4f 和扩展数据图 7f）。值得注意的是，H3K27ac 并未观察到这种趋势，这表明这一发现并非仅仅是 FOXP3⁺细胞比例增加的结果（扩展数据图 7g）。

  因为前面的研究结果表明 HDAC3 通过与 RBPJ 结合参与其中，接下来作者想确定组蛋白乙酰化在 FOXP3 调节中的相关作用背景。作者假设，在 FOXP3 基因处，由 HDAC3 介导的组蛋白乙酰化局部缺失，是导致 RBPJ 转导细胞中诱导调节性 T 细胞（iTreg）诱导效率和 FOXP3 表达降低的原因。然而，作者也希望避免因 RBPJ 过表达细胞中 FOXP3⁺诱导调节性 T 细胞（iTreg）比例降低而对组蛋白乙酰化产生的潜在混杂影响。为了克服这些技术限制，作者通过修改之前的 ASAP-seq [51] 胞内染色方案，开发了细胞内 ChIP-seq 和细胞内 ATAC-seq 技术，以便在分别进行 ChIP-seq 或 ATAC-seq 下游处理之前，通过流式细胞术特异性的富集表达 FOXP3 的细胞（扩展数据图 8a - c）。

对 RBPJ 转导的诱导调节性 T 细胞（iTreg）中 FOXP3⁺细胞进行 inChIP-seq 分析显示，与模拟转导的对照组相比，FOXP3 基因座处的 H3K9ac 和总 H3ac 水平降低（图 4g）。

  染色质可及性也有类似的减少，这种减少覆盖了 FOXP3 转录起始位点（TSS）和 CNS2 区域。为了进一步证实作者的发现，作者使用 CUT&RUN 技术，对正在进行诱导调节性 T 细胞（iTreg）分化的 RBPJ 转导细胞中 RBPJ 在 FOXP3 基因座的结合情况生成了高分辨率图谱。作者使用了一种 AM 标签特异性抗体来探测表位标记的 RBPJ，结果显示 RBPJ 在 FOXP3 转录起始位点（TSS）、CNS1 和 CNS0 处的染色质占有率富集（图 4g）。值得注意的是，突变型 RBPJ 也观察到了类似的结合模式，这表明 FOXP3 表达的恢复并非是突变体与 FOXP3 转录起始位点（TSS）的 DNA 结合能力受损导致的假象。作者发现突变型 RBPJ 不与 TGFβ 反应性增强子 CNS1 结合，这表明 RBPJ 通过 CNS1 的结合也可能是其对 FOXP3 诱导和表达进行负调控的原因。

  总之，这些结果都支持这样一个观点，即 RBPJ 与 NCOR 复合物的结合通过调节组蛋白乙酰化直接抑制了 FOXP3 的表达。

  为了评估这些发现的转化应用价值，作者测试了 RBPJ 缺失的诱导调节性 T 细胞（iTreg）在体内是否会表现出增强的功能，以及在异种移植物抗宿主病（GvHD）模型中能否改善其性能（图 5a）。

在这个模型中，接受非靶向对照（NTC）诱导调节性 T 细胞（iTreg）的小鼠未能免受移植物抗宿主病（GvHD）诱导的致死影响。

相比之下，接受天然调节性 T 细胞（nTreg）或 RBPJ 缺失的诱导调节性 T 细胞（iTreg）的小鼠则有显著改善，且诱导调节性 T 细胞（iTreg）表现出与天然调节性 T 细胞（nTreg）相似的效力（图 5b、c 和扩展数据图 9a、b）。

同样地，敲除 RBPJ 的诱导调节性 T 细胞（iTreg）在体内展现出持续稳定的 FOXP3 表达（图 5d、e 和扩展数据图 9c），这与体外实验观察结果一致（图 3）。

  总之，这些数据表明，敲除 RBPJ 能够有力地增强诱导调节性 T 细胞（iTreg）在体内介导的抑制效果，突显了对其进行调节可作为基于诱导调节性 T 细胞（iTreg）治疗方法中的一个新靶点。

【总结】

  调节性 T（Treg）细胞特异性表达主转录因子 FOXP3，在维持免疫耐受和稳态中起关键作用，并有可能改变现有的自身免疫疾病细胞治疗的方案。现有的诱导调节性 T 细胞的方法在人体内不适用，因此作者希望使用 CRISPR 技术筛选 FOXP3 的调节因子。

作者根据 FOXP3 的表达将细胞分成高低表达组，通过分析不同组的细胞中富集的 sgRNA 来寻找正负调节因子。对找到的 Top 的调节因子，作者进一步通过 CRISPR 进行单敲，验证筛选得到的调节因子的可靠性。然后在单细胞的转录组水平和胞内蛋白表达水平对这些转录因子进行了分析，最后通过模块分析，通过不同的调节因子之间的相互作用，选出了一个和很多调节因子具有相互作用的一个核心基因 RBPJ。

  因为 RBPJ 可以参与 Notch 信号通路发挥作用，因此作者希望验证 Notch 信号通路在 FOXP3 的表达方面是否发挥了调节作用，对相关蛋白进行敲除来验证，最后排除了 Notch 信号通路的作用。

同时，作者的 CRISPR 筛选依赖于 TCR 的预刺激，作者也通过实验排除了 TCR 预刺激的作用。

作者的研究证明了 RBPJ 的敲除可以提升 FOXP3 蛋白水平，可以提高 FOXP3 阳性细胞的比例，可以增强 FOXP3 在炎症环境下的稳定性，可以增强诱导调节性细胞的功能。

然后作者通过使用 151 种不同的 sgRNA 对 RBPJ 基因位点的外显子编码区进行了高密度诱变实验，确定了 RBPJ 发挥作用的区域。

当靶向编码 BTD 和 CTD 的序列时，可以观察到富集分数增加，这两个结构域都已被证明在介导 RBPJ 与 SMRT-NCOR 抑制复合物之间的相互作用界面中起着关键作用。

  最后，作者以 SMRT-NCOR 复合物中的 HDAC3 入手，发现 RBPJ 与 NCOR 复合物的结合通过调节组蛋白乙酰化直接抑制 FOXP3 表达。

DOI:https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5

                                                                  汇报人：罗苗苗