近日，赵玉成课题组团队以research article形式在最新一期ACS Catalysis上发表了题为“Discovery, Structure, and Mechanism of the (R, S)-Norcoclaurine Synthase for the Chiral Synthesis of Benzylisoquinoline Alkaloids”。本课题组2022级硕士生张李博为本文的共同第一作者（排一），中国科学院天津工生所张士清博士，中国药科大学廖李静博士为本文的共同第一作者，中国药科大学中药学院中药资源系赵玉成副教授、药学院肖易倍教授，中国科学院天津工生所盛翔研究员为论文的共同通讯作者。
立体化学自从被法国化学家及微生物学家路易·巴斯德提出以来就深深吸引了人类，且目前仍是广受关注的话题。立体化学在药学、生命科学和物理学等领域的重要作用吸引着人们探索它的起源、形成与功能。然而，自然界中手性天然产物的手性控制机制与手性的起源一直鲜有系统研究。苄基异喹啉生物碱（BIAs）是一类具有重要药用价值的次生代谢产物，广泛分布于罂粟科、木兰科、芸香科、小檗科等植物中（如吗啡、可待因、罂粟碱、荷叶碱、小檗碱、根碱等）且发挥着多种药理作用。目前已鉴定的大部分BIAs为（S）-型，但是（R）-型BIAs也可在某些植物（如罂粟，荷花）中特异性的累积。2015年，不同研究团队在Science，Nature Chemical Biology等杂志发文，几乎同时发现了罂粟产生（R）-型BIAs的关键STORR基因。2018年以来，我国学者也在Science，Nature communications等杂志上相继发文，进一步阐明了罂粟通过基因融合产生特殊STORR基因合成（R）-型BIAs 前体的机制，然而其手性控制与转换的机制未能得到详细的阐明。此外，其他植物如何产生（R）-BIAs的机制也未有报道。去甲乌药碱合成酶（NCS）介导的Pictet-Spengler缩合反应形成了BIAs的基本骨架以及第一个手性碳，理论上是BIAs化合物的手性来源。但目前报道的所有NCS都具有严格的（S）-型对映选择性，未发现具有（R）-型对映选择性的相关基因，导致罂粟以外（R）-型BIAs手性来源一直存在争议。
荷花（Nelumbo nucifera）是一种古老的水生植物，在古诗歌中象征着忠贞和爱情（图1，玄武湖并蒂莲），也具有一定的宗教色彩。此外，荷花也被阿育吠陀医学和中医学用于治疗痢疾、心律失常和炎症。正如它在艺术中的崇高和宗教中的神秘一样，荷花中的主要生物碱与大部分植物不同，不仅可以特异性累积（R）-BIAs，且含量较高。此外，尽管BIAs生物合成途径在多个植物如罂粟和黄连中都有报道，但在荷花中却少有报道。至于其为何可以累积（R）-BIAs，其手性控制的机制如何，都未有研究。
图1：并蒂莲（图片摄于南京玄武湖公园月影桥，由玄武湖公园工作人员提供）
针对荷花中大量特异积累（R）-BIAs这一独特性质，中国药科大学赵玉成/肖易倍团队联合中国科学院天津工生所盛翔团队综合基因组分析、功能验证、手性拆分等策略，首次发现了荷花产生（R）-型BIAs的关键基因NCS，并通过晶体结构解析，定点突变，量子化学计算等手段，解释了荷花特异性累积（R）-型BIAs的机制（图2），研究成果为（R）-型BIAs的合成生物学提供重要的酶学元件。
图2：荷花来源NCS酶的反应简图、反应势能面与手性分析
通过基因组分析，作者首先从荷花中筛选出五条NCS候选基因（NnNCS1, 3, 4, 5, 7），它们都属于病程相关蛋白10家族（PR-10）并含有保守的富甘氨酸基序“GDGTVG”。进而对蛋白纯化并进行活性测试，结果表明：五条NnNCS均具有催化多巴胺和4-羟基苯乙醛缩合形成BIAs骨架的能力（图3A）。随后他们对NnNCS1进行酶学研究，发现NnNCS1对多巴胺的动力学呈现了罕见的S曲线，即存在同促效应（图3B），而二甲基吗啡合成酶（THS）以及从黄唐松草中克隆的NCS（TfNCS）对多巴胺的动力学呈现米氏动力学曲线。同时，十八角度静态光散射结合分子排阻层析（SEC-MALS）发现NnNCS1在溶液中以同源二聚体的形式存在，而TfNCS则以单体的形式存在（图3C）。作者推测NnNCS和TfNCS这种结构上的差异可能导致二者具有不同的催化方式，或导致他们介导了不同（S）-/（R）-手性的形成。
图3：荷花NCS的功能验证
进而，作者使用柱前衍生化方法对NnNCS催化产物的构型进行分析。结果表明NnNCS产生（R）-和（S）-构型对映体的比例几乎相等（图4），该发现阐明了荷花中（R）-型BIAs的起源，这与罂粟中报道的需要一个额外的CYP450氧化还原蛋白以产生（R）-型对映体的合成机制截然不同。那么，为什么最终荷花可以特异性累积（R）-型BIAs呢？根据CYP80G只能特异性催化（R）-型BIAs，作者提出了荷花特异性累积（R）-型BIAs的“窗户-眼睛”模型，即NCS产生外消旋前驱体，另一个酶则特异性催化（R）-型异构体（图5）。
图4：荷花NCS的手性分析
图5：荷花特异性累积（R）-型BIAs的“窗户-眼睛”模型
接着，为了探究NnNCS的立体选择调控机制，作者解析了NnNCS1的晶体结构。其总体结构呈现同源二聚体形状，同时具有PR-10家族蛋白的一般特征（图6A）。作者将NnNCS1和TfNCS的晶体结构进行了比对，并以此推测它们不同手性异构体产生的机理。结果发现两个蛋白表现出不同的二聚体结构，与SEC-MALS结果一致。此外，尽管两个酶的大致结构相似，它们的活性位点结构有所不同（图6C）。TfNCS中的关键氨基酸Glu110，Lys122和Asp141在酶促反应中起到常规酸-碱基团的重要作用，这些氨基酸分别对应NnNCS1中的Glu72，Lys84和Val103。TfNCS中带负电荷的残基Asp141在NnNCS1中则为Val103。相较于TfNCS，NnNCS1的活性位点包含更多芳香残基，例如TfNCS中的Leu72和Ala79在NnNCS1中分别为Phe32和Tyr40，由此可以推测，两个酶活性口袋周围关键氨基酸的变化会导致不同的底物结合方式，并造成不同亚胺中间体在活性中心具有不同的构象，并最终影响产物的构型选择性。
图6：荷花NCS与黄唐松草NCS的晶体结构对比图
为了验证以上假设，作者进行了量子化学计算和点突变实验。基于本文解析的NnNCS1晶体结构，作者将多巴胺和4-HPAA手动加入活性位点来构建量子化学团簇模型。在计算模型构建时，作者考虑了两个底物和活性位点残基具有多种不同构象和旋转异构体的酶-底物复合物。通过结构优化和能量计算，最终确定了具有较低能量的系列酶-底物复合物结构。这些结构被用于研究反应的化学步骤，并最终确定了反应的最低能量路径（图7）。最终确定了Glu72和Lys84作为关键酸-碱基团在催化质子转移步骤中起关键作用，而Tyr40是控制构型选择性的关键氨基酸。基于量子化学计算得到的能量和结构等相关信息，作者开展了酶的理性设计工作。对Il43、Ile58、Leu60和Phe101等关键残基进行了理性设计，近半数突变体表现出了（R）-对映选择性。该研究为后续手性BIAs的合成生物学提供了重要参考与关键酶学元件。
图7：荷花NCS的催化机制
本工作感谢中国药科大学秦民坚教授、王小兵教授、陕西中医药大学徐顶巧副教授、南通大学王雯丽博士也提供的重要帮助。该工作也得到了国家重点研发计划、中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”、秦药特色资源研究开发重点实验室开放课题、安徽省大别山中医药研究院开放课题的资助。
