黄酮类化合物广泛存在于自然界中尤其是植物，它们具有良好的抗癌、抗氧化、抗糖尿病等活性。柚皮素作为黄酮类化合物的通用中间体，其合成途径已经被解析清楚。在植物和细菌中，柚皮素的合成以对香豆酸为底物，先经4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）催化生成对香豆酰辅酶A。然后，一分子对香豆酰辅酶A与三分子丙二酰辅酶A经III型PKS查尔酮合成酶（CHS）缩合生成柚皮素查尔酮，最后经查尔酮异构酶催化或pH改变自发形成柚皮素。值得一提的是，虽然4CL和CHS已在一些植物内生真菌中被鉴定，但并没有遗传或生化证明它们的功能。目前真菌中也没有其他酶催化合成柚皮素的报道。
基于基因组挖掘，作者从一株植物内生真菌Pestalotiopsis fici中发现一个NRPS-PKS杂合酶FnsA（A-T-KS-AT-DH-KR-ACP-TE），该酶与Aspergillus campestris中推测催化黄酮化合物chlorflavonin骨架形成的NRPS-PKS杂合酶（P168DRAFT_323099）具有64.3%的同源性。为了研究FnsA的功能，作者敲除了fnsA，结果发现，敲除株次级代谢产物未发生明显变化（图1c），这说明fnsA是沉默的，该结果与前期转录组数据一致。为了激活fnsA的表达，作者将fnsA在构巢曲霉中进行异源表达，HPLC结果表明fnsA构巢突变株相较于对照组产生了两个新的化合物峰（1和2），通过化合物分离和结构鉴定，最终确定1和2分别是为柚皮素（1）和柚皮素查尔酮（2）（图1d）。进一步地，作者在酿酒酵母中表达了fnsA，分析fnsA酵母突变株次级代谢产物后发现有微量的1产生（图2a），作者推测可能是酵母中FnsA的底物供应不足导致的。底物饲喂实验结果表明当喂养对香豆酸（3）或对羟基苯甲酸（4）后，1的产量得到显著提高（图2b）。喂养氘代标记底物3-d6 和4-d4到fnsA酵母突变株后，LC-MS分析显示柚皮素的分子量相应地增加6 Da和4 Da（图2c-d）。这些结果都证明FnsA利用3和4为底物一步合成1。
图1：真菌NRPS-PKS杂合酶FnsA的挖掘及在构巢曲霉中的异源表达
图2：fnsA在酿酒酵母中的异源表达及功能鉴定
根据NRPS和PKS的合成机制，作者推测FnsA的腺苷酰化结构域负责识别活化底物3和4为acyl-O-AMP，随后共价结合到硫醇化结构域上形成酰基硫酯；接着FnsAPKS引入丙二酰辅酶A进行链延伸。为了验证该猜想，作者将fnsAA-T 和fnsAPKS分别在酵母中进行表达和共表达，同时进行底物饲喂实验。结果表明只有fnsAA-T 和fnsAPKS共同表达时才能产生1（图3），这证明fnsAA-T对于底物的活化是必需的。进一步作者通过体外酶促反应及LC-MS/MS研究了FnsA腺苷酰化结构域的功能，结果证实了FnsA腺苷酰化结构域负责3或4的腺苷化和硫酯化，然后共价结合到FnsA硫醇化结构域的磷酸泛酰巯基乙胺的硫醇上（图4）。
图3：fnsAA-T 和fnsAPKS在酿酒酵母中的异源表达及催化机制解析
图4：FnsA腺苷酰化结构域的功能鉴定
CHS是植物中用于合成柚皮素的III型PKS，使用辅酶A形式的单元作为底物合成柚皮素。然而FnsA催化游离芳基酸(p-CA或p-HBA)直接产生柚皮素。这种差异引起了作者对于FnsA聚酮部分的好奇。因此，作者对FnsA的KS结构域进行了系统发育分析（图5a）。结果显示，FnsA聚酮部分是I型PKS，说明FnsA是一种新的柚皮素合酶。综上，作者提出了P. fici中柚皮素的生物合成途径，p-CA（3）和p-HBA（4）作为起始单元，被FnsA的腺苷酰化结构域识别，然后以硫酯形式锚定在相邻的硫醇化结构域上。活化后的3或4随后分别被FnsA的KS结构域用3个或4个丙二酰辅酶A单元进行链的延伸。然后，柚皮素查尔酮经克莱森缩合反应自发或TE结构域介导产物释放，最后通过查尔酮异构酶CHI或自发非酶促反应将柚皮素查尔酮转化为柚皮素（图5b）。
图5：FnsA KS结构域的系统进化分析及真菌柚皮素的合成途径
综上，该研究挖掘并鉴定了一个新的NRPS-PKS杂合酶FnsA，作为一个新的柚皮素合酶，不同于植物细菌中由III型PKS催化多步合成柚皮素的合成途径，FnsA能以游离酸（对香豆酸或对羟基苯甲酸）为底物直接合成柚皮素，FnsA的发现为微生物高效生产植物活性黄酮类化合物提供了新策略。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金项目、国家自然科学基金国际合作项目、中国科学院基础前沿科学研究计划从0到1原始创新项目、中国科学院战略生物资源计划以及博士后科学基金的资助。