The type IV P-type ATPases (P4-ATPases) thus far characterized are lipid flippases that transport specific substrates, such as phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE), from the exofacial leaflet to the cytofacial leaflet of membranes. This transport activity generates compositional asymmetry between the two leaflets important for signal transduction, cytokinesis, vesicular transport, and host-pathogen interactions. Most P4-ATPases function as a heterodimer with a β-subunit from the Cdc50 protein family, but Neo1 from Saccharomyces cerevisiae and its metazoan orthologs lack a β-subunit requirement and it is unclear how these proteins transport substrate. Here we tested if residues linked to lipid substrate recognition in other P4-ATPases also contribute to Neo1 function in budding yeast. Point mutations altering entry gate residues in the first (Q209A) and fourth (S457Q) transmembrane segments of Neo1, where phospholipid substrate would initially be selected, disrupt PS and PE membrane asymmetry, but do not perturb growth of cells. Mutation of both entry gate residues inactivates Neo1, and cells expressing this variant are inviable. We also identified a gain-of-function mutation in the second transmembrane segment of Neo1 (Neo1[Y222S]), predicted to help form the entry gate, that substantially enhances Neo1's ability to replace the function of a well characterized phospholipid flippase, Drs2, in establishing PS and PE asymmetry. These results suggest a common mechanism for substrate recognition in widely divergent P4-ATPases.

中文翻译：

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酿酒酵母的P4-ATPase Neo1识别磷脂底物的保守机制。

迄今为止，IV型P型ATP酶（P4-ATPase）的特征是脂质脂酶，可将特定的底物（例如磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE））从面膜小叶转运至膜的细胞面小叶。这种转运活性在两个小叶之间产生成分不对称性，这对于信号转导，胞质分裂，囊泡转运和宿主-病原体相互作用很重要。大多数P4-ATPases具有Cdc50蛋白家族的β-亚基的异二聚体功能，但是酿酒酵母及其后生直系同源物Neo1缺乏β-亚基的要求，目前尚不清楚这些蛋白如何运输底物。在这里，我们测试了与其他P4-ATPase中脂质底物识别相关的残基是否也对发芽酵母中的Neo1功能起作用。点突变会改变Neo1的第一个（Q209A）和第四个（S457Q）跨膜片段中的入口门残基，最初将选择磷脂底物，破坏PS和PE膜的不对称性，但不会干扰细胞的生长。两个入口门残基的突变都会使Neo1失活，表达这种变异的细胞是不可行的。我们还确定了Neo1的第二个跨膜区段（Neo1 [Y222S]）的功能获得突变，预计该突变有助于形成进入门，从而实质上增强Neo1取代特征明确的磷脂酶，Drs2，建立PS和PE不对称性。这些结果表明在广泛不同的P4-ATPases中底物识别的常见机制。最初选择磷脂底物的地方会破坏PS和PE膜的不对称性，但不会干扰细胞的生长。两个入口门残基的突变都会使Neo1失活，表达这种变异的细胞是不可行的。我们还确定了Neo1的第二个跨膜区段（Neo1 [Y222S]）的功能获得突变，预计该突变有助于形成进入门，从而实质上增强Neo1取代特征明确的磷脂酶，Drs2，建立PS和PE不对称性。这些结果表明在广泛不同的P4-ATPases中底物识别的常见机制。最初选择磷脂底物的地方会破坏PS和PE膜的不对称性，但不会干扰细胞的生长。两个入口门残基的突变都会使Neo1失活，表达这种变异的细胞是不可行的。我们还确定了Neo1的第二个跨膜区段（Neo1 [Y222S]）的功能获得突变，预计该突变有助于形成进入门，从而实质上增强Neo1取代特征明确的磷脂酶，Drs2，建立PS和PE不对称性。这些结果表明在广泛不同的P4-ATPases中底物识别的常见机制。我们还确定了Neo1的第二个跨膜区段（Neo1 [Y222S]）的功能获得突变，预计该突变有助于形成进入门，从而实质上增强Neo1取代特征明确的磷脂酶，Drs2，建立PS和PE不对称性。这些结果表明在广泛不同的P4-ATPases中底物识别的常见机制。我们还确定了Neo1的第二个跨膜区段（Neo1 [Y222S]）的功能获得突变，预计该突变有助于形成进入门，从而实质上增强Neo1取代特征明确的磷脂酶，Drs2，建立PS和PE不对称性。这些结果表明在广泛不同的P4-ATPases中底物识别的常见机制。