BACKGROUND In 2017-2018, a new highly pathogenic H5N6 avian influenza virus (AIV) variant appeared in poultry and wild birds in Asian and European countries and caused multiple outbreaks. These variant strains are different from the H5N6 virus associated with human infection in previous years, and their genetic taxonomic status and antigenicity have changed. Therefore, revision of the primers and probes of fluorescent RT-PCR is important to detect the new H5N6 subtype AIV in poultry and reduce the risk of an epidemic in birds or humans. METHODS In this study, the primers and probes including three groups of HA and four groups of NA for H5N6 influenza virus were evaluated. Then a set of ideal primer and probes were selected to further optimize the reaction system and established a method of double rRT-PCR assay. The specificity of this method was determined by using H1~H16 subtype AIV. RESULTS The results showed that fluorescence signals were obtained for H5 virus in FAM channel and N6 virus in VIC channel, and no fluorescent signal was observed in other subtypes of avian influenza viruses. The detection limit of this assay was 69 copies for H5 and 83 copies for N6 gene. And, the variability tests of intra- and inter-assay showed excellent reproducibility. Moreover, this assay showed 100% agreement with virus isolation method in detecting samples from poultry. CONCLUSION The duplex rRT-PCR assay presented here has high specificity, sensitivity and reproducibility, and can be used for laboratory surveillance and rapid diagnosis of newly emerged H5N6 subtype avian influenza viruses.

中文翻译：

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开发用于同时检测新出现的H5N6流感病毒的双重TaqMan实时RT-PCR分析方法。

背景技术在2017-2018年间，亚洲和欧洲国家的家禽和野禽中出现了一种新的高致病性H5N6禽流感病毒（AIV）变种，并引起了多次暴发。这些变异株不同于前几年与人类感染相关的H5N6病毒，并且它们的遗传分类状态和抗原性也发生了变化。因此，荧光RT-PCR的引物和探针的修订对于检测禽类中新的H5N6亚型AIV和降低禽鸟或人类流行的风险非常重要。方法在本研究中，评估了用于H5N6流感病毒的包括三组HA和四组NA的引物和探针。然后选择一组理想的引物和探针以进一步优化反应体系，并建立了双重rRT-PCR检测方法。该方法的特异性通过使用H1〜H16亚型AIV来确定。结果结果表明，在FAM通道中获得了H5病毒的荧光信号，在VIC通道中获得了N6病毒的荧光信号，在其他亚型禽流感病毒中均未观察到荧光信号。该测定的检测限为H5为69个拷贝，N6基因为83个拷贝。并且，批内和批间的变异性测试显示出极好的可重复性。此外，该测定法在检测禽肉样品中与病毒分离方法具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。结果结果表明，在FAM通道中获得了H5病毒的荧光信号，在VIC通道中获得了N6病毒的荧光信号，在其他亚型禽流感病毒中均未观察到荧光信号。该测定的检测限为H5为69个拷贝，N6基因为83个拷贝。并且，批内和批间的变异性测试显示出极好的可重复性。此外，该测定法在检测禽肉样品中与病毒分离方法具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。结果结果表明，在FAM通道中获得了H5病毒的荧光信号，在VIC通道中获得了N6病毒的荧光信号，在其他亚型禽流感病毒中均未观察到荧光信号。该测定的检测限为H5为69个拷贝，N6基因为83个拷贝。并且，批内和批间的变异性测试显示出极好的可重复性。此外，该测定法在检测禽肉样品中与病毒分离方法具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。在其他亚型禽流感病毒中未观察到荧光信号。该测定的检测限为H5为69个拷贝，N6基因为83个拷贝。并且，批内和批间的变异性测试显示出极好的可重复性。此外，该测定法在检测禽肉样品中与病毒分离方法具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。在其他亚型禽流感病毒中未观察到荧光信号。该测定的检测限为H5为69个拷贝，N6基因为83个拷贝。并且，批内和批间的变异性测试显示出极好的可重复性。此外，该测定法在检测禽肉样品中与病毒分离方法具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。该检测方法与病毒分离方法在检测家禽样品中具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。该检测方法与病毒分离方法在检测家禽样品中具有100％的一致性。结论本文提出的双重rRT-PCR测定法具有高度的特异性，敏感性和可重复性，可用于实验室监测和快速诊断新出现的H5N6亚型禽流感病毒。