BACKGROUND Protein kinase C θ has been established as an important signaling intermediate in T-effector-cell activation and survival pathways by controlling activity of the key transcription factors NF-κB and NFAT. Previous studies identified an activation-induced auto-phosphorylation site at Thr-219, located between the tandem C1 domains of the regulatory fragment in PKCθ, as a structural requirement for its correct membrane translocation and the subsequent transactivation of downstream signals leading to IL-2 production in a human T cell line. METHODS The present work aimed to define the role of this phosphorylation switch on PKCθ in a physiological context through a homozygous T219A knockin mouse strain. T cell activation was analyzed by H3-thymidine uptake (proliferative response), qRT-PCR and luminex measurements (cytokine production). NFAT and NF-κB transactivation responses were estimated by Gel mobility shift and Alpha Screen assays. Frequencies of T cell subsets were analyzed by flow cytometry. RESULTS Despite a normal T cell development, in vitro activated effector T cells clearly revealed a requirement of Thr-219 phosphorylation site on PKCθ for a transactivation of NF-κB and NFAT transcription factors and, subsequently, robust IL-2 and IFN-γ expression. CONCLUSION This phenotype is reminiscent of the PKCθ knockout T cells, physiologically validating that this (p) Thr-219 auto-phosphorylation site indeed critically regulates PKCθ function in primary mouse T cells.

中文翻译：

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PKCθT219A 敲入小鼠品系的功能丧失表型。

背景 通过控制关键转录因子 NF-κB 和 NFAT 的活性，蛋白激酶 C θ 已被确定为 T 效应细胞活化和存活途径中的重要信号中间体。先前的研究在 Thr-219 处发现了一个激活诱导的自磷酸化位点，位于 PKCθ 中调控片段的串联 C1 结构域之间，作为其正确膜易位和随后导致 IL-2 的下游信号的反式激活的结构要求在人类 T 细胞系中生产。方法 目前的工作旨在通过纯合 T219A 敲入小鼠品系来确定这种磷酸化开关在生理环境中对 PKCθ 的作用。通过 H3-胸苷摄取（增殖反应）、qRT-PCR 和 luminex 测量（细胞因子产生）分析 T 细胞活化。NFAT 和 NF-κB 反式激活反应通过凝胶迁移率变化和 Alpha Screen 测定进行估计。通过流式细胞术分析 T 细胞亚群的频率。结果 尽管 T 细胞发育正常，但体外激活的效应 T 细胞清楚地表明，PKCθ 上的 Thr-219 磷酸化位点需要 NF-κB 和 NFAT 转录因子的反式激活，以及随后的 IL-2 和 IFN-γ 的强表达. 结论 这种表型让人想起 PKCθ 敲除 T 细胞，从生理学上证实，这个 (p) Thr-219 自动磷酸化位点确实严格调节了原代小鼠 T 细胞中的 PKCθ 功能。体外激活的效应 T 细胞清楚地揭示了 PKCθ 上的 Thr-219 磷酸化位点需要 NF-κB 和 NFAT 转录因子的反式激活，以及随后的 IL-2 和 IFN-γ 表达。结论 这种表型让人想起 PKCθ 敲除 T 细胞，从生理学上证实，这个 (p) Thr-219 自动磷酸化位点确实严格调节了原代小鼠 T 细胞中的 PKCθ 功能。体外激活的效应 T 细胞清楚地揭示了 PKCθ 上的 Thr-219 磷酸化位点需要 NF-κB 和 NFAT 转录因子的反式激活，以及随后的 IL-2 和 IFN-γ 表达。结论 这种表型让人想起 PKCθ 敲除 T 细胞，从生理学上证实，这个 (p) Thr-219 自动磷酸化位点确实严格调节了原代小鼠 T 细胞中的 PKCθ 功能。