The isolation of integral membrane proteins for structural analysis remains challenging and this is particularly the case for eukaryotic membrane proteins. Here we describe our efforts to isolate OsBOR3, a boron transporter from Oryza sativa. OsBOR3 was expressed as both full length and a C-terminally truncated form lacking residues 643-672 (OsBOR3Δ1-642). While both express well as C-terminal GFP fusion proteins in Saccharomyces cerevisiae, the full length protein isolates poorly in the detergent dodecyl-β-d-maltoside (DDM). The OsBOR3Δ1-642 isolated in DDM in large quantities but was contaminated with GFP tagged protein, indicated incomplete protease removal of the tag. Addition of the reducing agent dithiothreitol (DTT) had no effect on isolation. Detergent screening indicated that the neopentyl glycol detergents, LMNG, UDMNG and DMNG conferred greater stability on the OsBOR3Δ1-642 than DDM. Isolation of OsBOR3Δ1-642 in LMNG both in the presence and absence of DTT produced large quantities of protein but contaminated with GFP tagged protein. Isolation of OsBOR3Δ1-642 in DMNG + DTT resulted in protein sample that does not contain any detectable GFP but elutes at a higher retention volume than that seen for protein isolated in either DDM or LMNG. Mass spectrometry confirmed that the LMNG and DMNG purified protein is OsBOR3Δ1-642 indicating that the DMNG isolated protein is monomer compared to the dimer isolated using LMNG. This was further supported by single particle electron microscopic analysis revealing that the DMNG protein particles are roughly half the size of the LMNG protein particles.

中文翻译：

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成功分离真核转运蛋白的策略。

用于结构分析的完整膜蛋白的分离仍然具有挑战性，对于真核膜蛋白尤其如此。在这里，我们描述了我们从水稻中分离出硼转运蛋白OsBOR3的努力。OsBOR3被表达为全长和缺乏残基643-672（OsBOR3Δ1-642）的C末端截短形式。尽管两者在啤酒酵母中均能很好地表达C端GFP融合蛋白，但全长蛋白在去污剂十二烷基-β-d-麦芽糖苷（DDM）中的分离效果很差。在DDM中大量分离出OsBOR3Δ1-642，但被GFP标记的蛋白质污染，表明该标记的蛋白酶去除不完全。添加还原剂二硫苏糖醇（DTT）对分离没有影响。洗涤剂筛选表明，新戊二醇洗涤剂LMNG，与DDM相比，UDMNG和DMNG在OsBOR3Δ1-642上具有更大的稳定性。在存在和不存在DTT的情况下，LMNG中OsBOR3Δ1-642的分离均产生大量蛋白，但被GFP标签蛋白污染。在DMNG + DTT中分离OsBOR3Δ1-642产生的蛋白质样品不含任何可检测的GFP，但洗脱的保留体积比DDM或LMNG中分离的蛋白质的保留体积高。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。在存在和不存在DTT的情况下，LMNG中OsBOR3Δ1-642的分离均产生大量蛋白，但被GFP标签蛋白污染。在DMNG + DTT中分离OsBOR3Δ1-642产生的蛋白质样品不含任何可检测的GFP，但洗脱的保留体积比DDM或LMNG中分离的蛋白质的保留体积高。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。在存在和不存在DTT的情况下，LMNG中OsBOR3Δ1-642的分离均产生大量蛋白，但被GFP标签蛋白污染。在DMNG + DTT中分离OsBOR3Δ1-642产生的蛋白质样品不含任何可检测的GFP，但洗脱的保留体积比DDM或LMNG中分离的蛋白质的保留体积高。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。在DMNG + DTT中分离OsBOR3Δ1-642产生的蛋白质样品不含任何可检测的GFP，但洗脱的保留体积比DDM或LMNG中分离的蛋白质的保留体积高。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。在DMNG + DTT中分离OsBOR3Δ1-642产生的蛋白质样品不含任何可检测的GFP，但洗脱的保留体积比DDM或LMNG中分离的蛋白质的保留体积高。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。质谱证实，LMNG和DMNG纯化的蛋白是OsBOR3Δ1-642，这表明与使用LMNG分离的二聚体相比，DMNG分离的蛋白是单体。单颗粒电子显微镜分析进一步支持了这一点，揭示了DMNG蛋白颗粒大约是LMNG蛋白颗粒的一半。