Mechanistic target of rapamycin (mTOR) complex 2 (mTORC2) regulates metabolism, cell proliferation, and cell survival. mTORC2 activity is stimulated by growth factors, and it phosphorylates the hydrophobic motif site of the AGC kinases AKT, SGK, and PKC. However, the proteins that interact with mTORC2 to control its activity and localization remain poorly defined. To identify mTORC2-interacting proteins in living cells, we tagged endogenous RICTOR, an essential mTORC2 subunit, with the modified BirA biotin ligase BioID2 and performed live-cell proximity labeling. We identified 215 RICTOR-proximal proteins, including proteins with known mTORC2 pathway interactions, and 135 proteins (63%) not previously linked to mTORC2 signaling, including nuclear and cytoplasmic proteins. Our imaging and cell fractionation experiments suggest nearly 30% of RICTOR is in the nucleus, hinting at potential nuclear functions. We also identified 29 interactors containing RICTOR-dependent, insulin-stimulated phosphorylation sites, thus providing insight into mTORC2-dependent insulin signaling dynamics. Finally, we identify the endogenous ADP ribosylation factor 1 (ARF1) GTPase as an mTORC2-interacting protein. Through gain-of-function and loss-of-function studies, we provide functional evidence that ARF1 may negatively regulate mTORC2. In summary, we present a new method of studying endogenous mTORC2, a resource of RICTOR/mTORC2 protein interactions in living cells, and a potential mechanism of mTORC2 regulation by the ARF1 GTPase.

雷帕霉素 (mTOR) 复合物 2 (mTORC2) 的机制靶标调节代谢、细胞增殖和细胞存活。mTORC2 活性受生长因子的刺激，并磷酸化 AGC 激酶 AKT、SGK 和 PKC 的疏水基序位点。然而，与 mTORC2 相互作用以控制其活性和定位的蛋白质仍然不清楚。为了鉴定活细胞中的 mTORC2 相互作用蛋白，我们用修饰的 BirA 生物素连接酶 BioID2 标记了内源性 RICTOR（一种必需的 mTORC2 亚基），并进行了活细胞邻近标记。我们鉴定了 215 种 RICTOR 近端蛋白质，包括具有已知 mTORC2 通路相互作用的蛋白质，以及 135 种蛋白质 (63%) 以前未与 mTORC2 信号相关，包括核蛋白和细胞质蛋白。我们的成像和细胞分离实验表明，近 30% 的 RICTOR 在细胞核中，暗示潜在的核功能。我们还确定了 29 个包含 RICTOR 依赖性胰岛素刺激磷酸化位点的相互作用因子，从而提供对 mTORC2 依赖性胰岛素信号动力学的深入了解。最后，我们将内源性 ADP 核糖基化因子 1 (ARF1) GTP 酶鉴定为 mTORC2 相互作用蛋白。通过功能获得和功能丧失研究，我们提供了 ARF1 可能负向调节 mTORC2 的功能证据。总之，我们提出了一种研究内源性 mTORC2 的新方法，即活细胞中 RICTOR/mTORC2 蛋白相互作用的资源，以及 ARF1 GTPase 调节 mTORC2 的潜在机制。我们还确定了 29 个包含 RICTOR 依赖性胰岛素刺激磷酸化位点的相互作用因子，从而提供对 mTORC2 依赖性胰岛素信号动力学的深入了解。最后，我们将内源性 ADP 核糖基化因子 1 (ARF1) GTP 酶鉴定为 mTORC2 相互作用蛋白。通过功能获得和功能丧失研究，我们提供了 ARF1 可能负向调节 mTORC2 的功能证据。总之，我们提出了一种研究内源性 mTORC2 的新方法，即活细胞中 RICTOR/mTORC2 蛋白相互作用的资源，以及 ARF1 GTPase 调节 mTORC2 的潜在机制。我们还确定了 29 个包含 RICTOR 依赖性胰岛素刺激磷酸化位点的相互作用因子，从而提供对 mTORC2 依赖性胰岛素信号动力学的深入了解。最后，我们将内源性 ADP 核糖基化因子 1 (ARF1) GTP 酶鉴定为 mTORC2 相互作用蛋白。通过功能获得和功能丧失研究，我们提供了 ARF1 可能负向调节 mTORC2 的功能证据。总之，我们提出了一种研究内源性 mTORC2 的新方法，即活细胞中 RICTOR/mTORC2 蛋白相互作用的资源，以及 ARF1 GTPase 调节 mTORC2 的潜在机制。通过功能获得和功能丧失研究，我们提供了 ARF1 可能负向调节 mTORC2 的功能证据。总之，我们提出了一种研究内源性 mTORC2 的新方法，即活细胞中 RICTOR/mTORC2 蛋白相互作用的资源，以及 ARF1 GTPase 调节 mTORC2 的潜在机制。通过功能获得和功能丧失研究，我们提供了 ARF1 可能负向调节 mTORC2 的功能证据。总之，我们提出了一种研究内源性 mTORC2 的新方法，即活细胞中 RICTOR/mTORC2 蛋白相互作用的资源，以及 ARF1 GTPase 调节 mTORC2 的潜在机制。