Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies targeting single antigens have performed poorly in clinical trials for solid tumors due to heterogenous expression of tumor-associated antigens (TAAs), limited T cell persistence, and T cell exhaustion. Here, we aimed to identify optimal CARs against glypican 2 (GPC2) or CD276 (B7-H3), which were highly but heterogeneously expressed in neuroblastoma (NB), a lethal extracranial solid tumor of childhood. First, we examined CAR T cell expansion in the presence of targets by digital droplet PCR. Next, using pooled competitive optimization of CAR by cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-Seq), termed P-COCC, we simultaneously analyzed protein and transcriptome expression of CAR T cells to identify high-activity CARs. Finally, we performed cytotoxicity assays to identify the most effective CAR against each target and combined the CARs into a bicistronic “OR” CAR (BiCisCAR). BiCisCAR T cells effectively eliminated tumor cells expressing GPC2 or CD276. Furthermore, the BiCisCAR T cells demonstrated prolonged persistence and resistance to exhaustion when compared with CARs targeting a single antigen. This study illustrated that targeting multiple TAAs with BiCisCAR may overcome heterogenous expression of target antigens in solid tumors and identified a potent, clinically relevant CAR against NB. Moreover, our multimodal approach integrating competitive expansion, P-COCC, and cytotoxicity assays is an effective strategy to identify potent CARs among a pool of candidates.

中文翻译：

---

针对 GPC2 或 CD276 的优化双顺反子嵌合抗原受体克服了神经母细胞瘤中的异质表达

由于肿瘤相关抗原 (TAA) 的异质表达、有限的 T 细胞持久性和 T 细胞耗竭，靶向单一抗原的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法在实体瘤的临床试验中表现不佳。在这里，我们旨在确定针对 glypican 2 (GPC2) 或 CD276 (B7-H3) 的最佳 CAR，它们在儿童致命的颅外实体瘤神经母细胞瘤 (NB) 中高度但异质地表达。首先，我们通过数字液滴 PCR 检测了存在靶标的情况下的 CAR T 细胞扩增。接下来，我们通过测序（CITE-Seq）对转录组和表位进行细胞索引对 CAR 进行综合竞争优化，称为 P-COCC，同时分析 CAR T 细胞的蛋白质和转录组表达以鉴定高活性 CAR。最后，我们进行了细胞毒性测定，以确定针对每个靶点的最有效 CAR，并将 CAR 组合成双顺反子“OR”CAR（BiCisCAR）。BiCisCAR T 细胞有效地消除了表达 GPC2 或 CD276 的肿瘤细胞。此外，与靶向单一抗原的 CAR 相比，BiCisCAR T 细胞表现出更长的持久性和抗疲劳性。该研究表明，使用 BiCisCAR 靶向多种 TAA 可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达，并确定了一种有效的、临床相关的针对 NB 的 CAR。此外，我们整合竞争性扩张、P-COCC 和细胞毒性测定的多模式方法是在候选池中识别有效 CAR 的有效策略。BiCisCAR T 细胞有效地消除了表达 GPC2 或 CD276 的肿瘤细胞。此外，与靶向单一抗原的 CAR 相比，BiCisCAR T 细胞表现出更长的持久性和抗疲劳性。该研究表明，使用 BiCisCAR 靶向多种 TAA 可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达，并确定了一种有效的、临床相关的针对 NB 的 CAR。此外，我们整合竞争性扩张、P-COCC 和细胞毒性测定的多模式方法是在候选池中识别有效 CAR 的有效策略。BiCisCAR T 细胞有效地消除了表达 GPC2 或 CD276 的肿瘤细胞。此外，与靶向单一抗原的 CAR 相比，BiCisCAR T 细胞表现出更长的持久性和抗疲劳性。该研究表明，使用 BiCisCAR 靶向多种 TAA 可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达，并确定了一种有效的、临床相关的针对 NB 的 CAR。此外，我们整合竞争性扩张、P-COCC 和细胞毒性测定的多模式方法是在候选池中识别有效 CAR 的有效策略。该研究表明，使用 BiCisCAR 靶向多种 TAA 可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达，并确定了一种有效的、临床相关的针对 NB 的 CAR。此外，我们整合竞争性扩张、P-COCC 和细胞毒性测定的多模式方法是在候选池中识别有效 CAR 的有效策略。该研究表明，使用 BiCisCAR 靶向多种 TAA 可以克服实体瘤中靶抗原的异质表达，并确定了一种有效的、临床相关的针对 NB 的 CAR。此外，我们整合竞争性扩张、P-COCC 和细胞毒性测定的多模式方法是在候选池中识别有效 CAR 的有效策略。