The EccC enzyme of Mycobacterium tuberculosis ESX-1 secretion system is involved in EsxAB virulence factor secretion and offers an attractive target for antivirulence inhibitors development against M. tuberculosis. The EccCb1 polypeptide of the EccC enzyme contains two Ftsk/SpoIIIE type ATPase domains (D2 and D3) and binds to the EsxAB factor at the C-terminal region of the D3 domain. In the current study, we have determined a low-resolution structure of EccCb1, and its mechanism involved in ATPase activity and EsxAB factor binding. Small-angle X-ray scattering data yielded a double hexameric ring structure of EccCb1 in solution and was further confirmed by SEC-MALS and dynamic light scattering. ATPase activity of wild-type, D2, and D3 mutants showed that D2-K90A and D3-K382A mutations led to a complete loss of enzyme activity. The full-length EccCb1 showed ∼3.7-fold lower catalytic efficiency than D2 domain and ∼1.7 fold lower than D3 domain. The EsxAB factor binds EccCb1 with Kd ∼ 11.3 ± 0.6 nM and its affinity is enhanced ∼2 fold in presence of ATP + Mg2+. These data indicate the involvement of ATPase activity in EsxAB factor translocation. Molecular dynamics simulation on wild-type, ATP + Mg2+, and EsxAB + ATP + Mg2+ bound EccCb1 double-ring structure showed enhanced stability of enzyme upon ATP + Mg2+ and EsxAB binding. Overall, our study showed a low-resolution structure of EccCb1, and the mechanism involved in ATPase activity and EsxAB factor recognition, which can be targeted for the development of antivirulence drugs against M. tuberculosis.

中文翻译：

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ATP 增强了结核分枝杆菌 EccCb1 ATPase 双六聚体环与 EsxAB 毒力因子的结合

结核分枝杆菌 ESX-1 分泌系统的 EccC 酶参与 EsxAB 毒力因子分泌，并为开发针对结核分枝杆菌的抗毒力抑制剂提供了一个有吸引力的目标。EccC 酶的 EccCb1 多肽包含两个 Ftsk/SpoIIIE 型 ATP 酶结构域（D2 和 D3）并在 D3 结构域的 C 末端区域与 EsxAB 因子结合。在目前的研究中，我们确定了 EccCb1 的低分辨率结构，其机制涉及 ATPase 活性和 EsxAB 因子结合。小角度 X 射线散射数据在溶液中产生了 EccCb1 的双六聚环结构，并通过 SEC-MALS 和动态光散射进一步证实。野生型、D2 和 D3 突变体的 ATP 酶活性表明 D2-K90A 和 D3-K382A 突变导致酶活性完全丧失。全长 EccCb1 的催化效率比 D2 域低 3.7 倍，比 D3 域低 1.7 倍。EsxAB 因子以 Kd ∼ 11.3 ± 0.6 nM 与 EccCb1 结合，并且在 ATP + Mg2+ 存在下其亲和力增强了 ∼2 倍。这些数据表明 ATPase 活性参与 EsxAB 因子易位。对野生型、ATP + Mg2+ 和 EsxAB + ATP + Mg2+ 结合的 EccCb1 双环结构的分子动力学模拟表明，酶在 ATP + Mg2+ 和 EsxAB 结合后的稳定性增强。总体而言，我们的研究显示了 EccCb1 的低分辨率结构，以及参与 ATPase 活性和 EsxAB 因子识别的机制，可用于开发抗结核分枝杆菌的抗毒药物。EsxAB 因子以 Kd ∼ 11.3 ± 0.6 nM 与 EccCb1 结合，并且在 ATP + Mg2+ 存在下其亲和力增强了 ∼2 倍。这些数据表明 ATPase 活性参与 EsxAB 因子易位。对野生型、ATP + Mg2+ 和 EsxAB + ATP + Mg2+ 结合的 EccCb1 双环结构的分子动力学模拟表明，酶在 ATP + Mg2+ 和 EsxAB 结合后的稳定性增强。总体而言，我们的研究显示了 EccCb1 的低分辨率结构，以及参与 ATPase 活性和 EsxAB 因子识别的机制，可用于开发抗结核分枝杆菌的抗毒药物。EsxAB 因子以 Kd ∼ 11.3 ± 0.6 nM 与 EccCb1 结合，并且在 ATP + Mg2+ 存在下其亲和力增强了 ∼2 倍。这些数据表明 ATPase 活性参与 EsxAB 因子易位。对野生型、ATP + Mg2+ 和 EsxAB + ATP + Mg2+ 结合的 EccCb1 双环结构的分子动力学模拟表明，酶在 ATP + Mg2+ 和 EsxAB 结合后的稳定性增强。总体而言，我们的研究显示了 EccCb1 的低分辨率结构，以及参与 ATPase 活性和 EsxAB 因子识别的机制，可用于开发抗结核分枝杆菌的抗毒药物。和 EsxAB + ATP + Mg2+ 结合的 EccCb1 双环结构显示酶在 ATP + Mg2+ 和 EsxAB 结合时的稳定性增强。总体而言，我们的研究显示了 EccCb1 的低分辨率结构，以及参与 ATPase 活性和 EsxAB 因子识别的机制，可用于开发抗结核分枝杆菌的抗毒药物。和 EsxAB + ATP + Mg2+ 结合的 EccCb1 双环结构显示酶在 ATP + Mg2+ 和 EsxAB 结合时的稳定性增强。总体而言，我们的研究显示了 EccCb1 的低分辨率结构，以及参与 ATPase 活性和 EsxAB 因子识别的机制，可用于开发抗结核分枝杆菌的抗毒药物。