Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – EU funding. Main funding source(s): Hungarian National Research, Development and Innovation Fund Introduction Smoke-induced diseases cause 20% of global mortality. The toxic agents of cigarette smoke have notorious destructive effects on the cardiovascular system. Therefore, many people use e-cigarettes instead of traditional tobacco products; yet, nicotine content remains the cause of addiction. Purpose Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) provide a useful personalised link between clinical and in vitro cardiovascular models. Here we generated hiPSC lines from a pair of identical twins with diabetes to test long and short-term effects of nicotine. Methods Blood samples were used to reprogram mononuclear cell fractions into hiPSC via Sendai viral transduction of the Yamanaka factors (Cytotune 2.0). Genotype and pluripotency of the iPSC were checked with FACS, PCR, immunocytochemistry and embryoid body formation. hiPSC line from non-diabetic healthy control ("GM") was used as control. The hiPSC lines were differentiated into endothelial cells and used in a toxicology and phenotypic assays. hiPSC-derived endothelial cells and control HUVEC were treated with e-cigarette liquid with (nicotine 0.225 mg/ml, ECL18) and without nicotine (ECL0) or nicotine in culture medium (0.225 mg/ml). The cells were analysed with high content microscopy (HCS, Opera), using Hoechst, apoptotic marker caspase3/7, mitochondrial TMRM and endothelial CD31 labelling. Results On the clinical side, one of the diabetic twins was a smoker ("C") and diagnosed and treated with a severe coronary disease, whilst the other ("D") was a non-smoker and no coronary artery disease. For the reprogrammed twin clones (normal, 46XX chromosomes), no differences in exome sequence were found. Cells were positive for pluripotency marker SSEA4 (>90%, FACS); Oct4 and Nanog were also positive, embryoid body formation and PCR were positive for all the three germ layers. The phenotypic fidelity of hiPSC-derived endothelial cells (hiPSC-EC) were different from the twin lines. C cell line showed a higher endothelial-to-mesenchymal transition rate and non-endothelial drift as compared to D line at 3 passages FACS after CD31 isolation (9% CD31+ vs 37% and 41%, for C, D and non-diabetic control, respectively). Nicotine did not change TMRM or caspase 3/7 activation in "C" hiPSC-EC, in turn it induced apoptosis in "D" cells (p=0.01 vs ECL18 and p=0.02 vs EGM2+nicotine, n=3). In GM and HUVEC endothelial cells, TMRM intensity increased after e-cigarette liquid treatment (all p<0.05, n=3) and caspase was higher group with ECL containing nicotine (p = 0.0178, n=3). "D" line endothelial cells showed higher cell loss to the nicotine diluted in EGM2, than in ECL (p = 0.0091, n=6). Conclusions Our developed a novel patient-specific hiPSC model where and in vitro toxicology assay showed alteration in endothelial phenotype associated with nicotine exposure. A scalable platform can provide further cohort level information on toxic agent like nicotine to the cardiovascular system.

中文翻译：

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使用来自同卵双胞胎的人诱导多能干细胞衍生的内皮细胞评估尼古丁对心血管的影响

资金致谢 资金来源类型：公共拨款——欧盟资金。主要资金来源：匈牙利国家研究、发展和创新基金 引言 烟雾引起的疾病占全球死亡率的 20%。香烟烟雾中的有毒物质对心血管系统具有众所周知的破坏作用。因此，很多人用电子烟代替了传统的烟草制品；然而，尼古丁含量仍然是成瘾的原因。目的 人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 在临床和体外心血管模型之间提供有用的个性化联系。在这里，我们从一对患有糖尿病的同卵双胞胎中生成了 hiPSC 系，以测试尼古丁的长期和短期影响。方法 通过山中因子 (Cytotune 2.0) 的仙台病毒转导，使用血液样本将单核细胞部分重编程为 hiPSC。用FACS、PCR、免疫细胞化学和胚状体形成检查iPSC的基因型和多能性。来自非糖尿病健康对照（“GM”）的hiPSC系用作对照。hiPSC 细胞系分化为内皮细胞并用于毒理学和表型分析。hiPSC 衍生的内皮细胞和对照 HUVEC 用含有（尼古丁 0.225 mg/ml，ECL18）和不含尼古丁（ECL0）或培养基中尼古丁（0.225 mg/ml）的电子烟液体处理。使用 Hoechst、凋亡标记 caspase3/7、线粒体 TMRM 和内皮 CD31 标记，用高内涵显微镜（HCS，Opera）分析细胞。结果在临床方面，糖尿病双胞胎中的一个是吸烟者（“C”）并被诊断出患有严重的冠状动脉疾病并接受了治疗，而另一个（“D”）是不吸烟者并且没有冠状动脉疾病。对于重编程的双胞胎（正常，46XX 染色体），没有发现外显子组序列的差异。细胞对多能性标志物SSEA4呈阳性（＞90%，FACS）；Oct4和Nanog也是阳性的，胚状体形成和PCR对所有三个胚层都是阳性的。hiPSC 衍生的内皮细胞 (hiPSC-EC) 的表型保真度与双系不同。与 D 系相比，C 细胞系在 CD31 分离后 3 代 FACS 显示出更高的内皮到间充质转化率和非内皮漂移（对于 C、D 和非糖尿病对照，C、D 和非糖尿病对照分别为 9% CD31+ vs 37% 和 41% ， 分别）。尼古丁不会改变“C”hiPSC-EC 中的 TMRM 或半胱天冬酶 3/7 活化，进而诱导“D”细胞凋亡（p=0.01 vs ECL18 和 p=0.02 vs EGM2+尼古丁，n=3）。在 GM 和 HUVEC 内皮细胞中，电子烟液处理后 TMRM 强度增加（均 p<0.05，n=3），并且半胱天冬酶在含有尼古丁的 ECL 组中较高（p = 0.0178，n=3）。“D”系内皮细胞在 EGM2 中稀释的尼古丁比在 ECL 中表现出更高的细胞损失（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。反过来，它在“D”细胞中诱导细胞凋亡（p=0.01 vs ECL18，p=0.02 vs EGM2+尼古丁，n=3）。在 GM 和 HUVEC 内皮细胞中，电子烟液处理后 TMRM 强度增加（均 p<0.05，n=3），并且半胱天冬酶在含有尼古丁的 ECL 组中较高（p = 0.0178，n=3）。“D”系内皮细胞在 EGM2 中稀释的尼古丁比在 ECL 中表现出更高的细胞损失（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。反过来，它在“D”细胞中诱导细胞凋亡（p=0.01 vs ECL18，p=0.02 vs EGM2+尼古丁，n=3）。在 GM 和 HUVEC 内皮细胞中，电子烟液处理后 TMRM 强度增加（均 p<0.05，n=3），并且半胱天冬酶在含有尼古丁的 ECL 组中较高（p = 0.0178，n=3）。“D”系内皮细胞在 EGM2 中稀释的尼古丁比在 ECL 中表现出更高的细胞损失（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。在 GM 和 HUVEC 内皮细胞中，电子烟液处理后 TMRM 强度增加（均 p<0.05，n=3），并且半胱天冬酶在含有尼古丁的 ECL 组中较高（p = 0.0178，n=3）。“D”系内皮细胞在 EGM2 中稀释的尼古丁比在 ECL 中表现出更高的细胞损失（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。在 GM 和 HUVEC 内皮细胞中，电子烟液处理后 TMRM 强度增加（均 p<0.05，n=3），并且半胱天冬酶在含有尼古丁的 ECL 组中较高（p = 0.0178，n=3）。“D”系内皮细胞在 EGM2 中稀释的尼古丁比在 ECL 中表现出更高的细胞损失（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。与 ECL 相比，线内皮细胞对 EGM2 中稀释的尼古丁的细胞损失更高（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。与 ECL 相比，线内皮细胞对 EGM2 中稀释的尼古丁的细胞损失更高（p = 0.0091，n = 6）。结论 我们开发了一种新的患者特异性 hiPSC 模型，其中体外毒理学分析显示与尼古丁暴露相关的内皮表型改变。一个可扩展的平台可以为心血管系统提供有关尼古丁等有毒物质的更多队列水平信息。