BACKGROUND Nanopore sequencing is direct sequencing of a single-stranded DNA molecule using biological pores. A portable nanopore-based sequencing device from Oxford Nanopore Technologies (MinION) depends on driving a DNA molecule through nanopores embedded in a membrane using a voltage. Changes in current are then measured by a sensor, thousands of times per second and translated to nucleobases. METHODS Genomic DNA (gDNA) samples (n = 13) were tested for Rh blood group D antigen (RHD) gene zygosity using droplet digital PCR. The RHD gene was amplified in 6 overlapping amplicons using long-range PCR. Amplicons were purified, and the sequencing library was prepared following the 1D Native barcoding gDNA protocol. Sequencing was carried out with 1D flow cells R9 version. Data analysis included basecalling, aligning to the RHD reference sequence, and calling variants. Variants detected were compared to the results acquired previously by the Ion Personal Genome Machine (Ion PGM). RESULTS Up to 500× sequence coverage across the RHD gene allowed accurate variant calling. Exonic changes in the RHD gene allowed RHD allele determination for all samples sequenced except 1 RHD homozygous sample, where 2 heterozygous RHD variant alleles are suspected. There were 3 known variant RHD alleles (RHD*01W.02, RHD*11, and RHD*15) and 6 novel RHD variant alleles, as previously seen in Ion PGM sequencing data for these samples. CONCLUSIONS MinION was effective in blood group genotyping, provided enough sequencing data to achieve high coverage of the RHD gene, and enabled confident calling of variants and RHD allele determination.

中文翻译：

---

使用基于便携式纳米孔的测序设备进行 Rh 血型 D 抗原基因分型：原理证明。

背景技术纳米孔测序是利用生物孔对单链DNA分子进行直接测序。来自 Oxford Nanopore Technologies (MinION) 的便携式基于纳米孔的测序设备依赖于使用电压驱动 DNA 分子通过嵌入膜中的纳米孔。然后传感器测量电流变化，每秒数千次，并转化为核碱基。方法 使用液滴数字 PCR 检测基因组 DNA (gDNA) 样本 (n = 13) 的 Rh 血型 D 抗原 (RHD) 基因接合性。使用远程 PCR 在 6 个重叠的扩增子中扩增 RHD 基因。纯化扩增子，并按照一维原生条形码 gDNA 协议制备测序文库。使用 1D 流通池 R9 版本进行测序。数据分析包括碱基识别、与 RHD 参考序列的比对、和调用变体。将检测到的变异与之前通过 Ion 个人基因组机器 (Ion PGM) 获得的结果进行比较。结果 RHD 基因高达 500× 的序列覆盖率允许准确的变异检出。RHD 基因的外显子变化允许对所有测序样本进行 RHD 等位基因测定，但 1 个 RHD 纯合样本除外，其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。将检测到的变异与之前通过 Ion 个人基因组机器 (Ion PGM) 获得的结果进行比较。结果 RHD 基因高达 500× 的序列覆盖率允许准确的变异检出。RHD 基因的外显子变化允许对所有测序样本进行 RHD 等位基因测定，但 1 个 RHD 纯合样本除外，其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。将检测到的变异与之前通过 Ion 个人基因组机器 (Ion PGM) 获得的结果进行比较。结果 RHD 基因高达 500× 的序列覆盖率允许准确的变异检出。RHD 基因的外显子变化允许对所有测序样本进行 RHD 等位基因测定，但 1 个 RHD 纯合样本除外，其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。结果 RHD 基因高达 500× 的序列覆盖率允许准确的变异检出。RHD 基因的外显子变化允许对所有测序样本进行 RHD 等位基因测定，但 1 个 RHD 纯合样本除外，其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。结果 RHD 基因高达 500× 的序列覆盖率允许准确的变异检出。RHD 基因的外显子变化允许对所有测序样本进行 RHD 等位基因测定，但 1 个 RHD 纯合样本除外，其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。其中怀疑有 2 个杂合 RHD 变异等位基因。有 3 个已知的变异 RHD 等位基因（RHD*01W.02、RHD*11 和 RHD*15）和 6 个新的 RHD 变异等位基因，如之前在这些样品的 Ion PGM 测序数据中所见。结论 MinION 在血型基因分型中是有效的，提供了足够的测序数据以实现 RHD 基因的高覆盖率，并能够可靠地调用变异和 RHD 等位基因测定。