AP4 (TFAP4) encodes a basic helix-loop-helix leucine zipper (bHLH-LZ) transcription factor and is a direct target gene of the oncogenic transcription factor c-MYC. Here, we set out to determine the relevance of AP4 in human colorectal cancer (CRC) cells. A CRISPR/Cas9 approach was employed to generate AP4-deficient CRC cell lines with inducible expression of c-MYC. Colony formation, β-gal staining, immunofluorescence, comet and homologous recombination (HR) assays and RNA-Seq analysis were used to determine the effects of AP4 inactivation. qPCR and qChIP analyses was performed to validate differentially expressed AP4 targets. Expression data from CRC cohorts was subjected to bioinformatics analyses. Immunohistochemistry was used to evaluate AP4 targets in vivo. Ap4-deficient APCmin/+ mice were analyzed to determine conservation. Immunofluorescence, chromosome and micronuclei enumeration, MTT and colony formation assays were used to determine the effects of AP4 inactivation and target gene regulation on chromosomal instability (CIN) and drug sensitivity. Inactivation of AP4 in CRC cell lines resulted in increased spontaneous and c-MYC-induced DNA damage, chromosomal instability (CIN) and cellular senescence. AP4-deficient cells displayed increased expression of the long non-coding RNA MIR22HG, which encodes miR-22-3p and was directly repressed by AP4. Furthermore, Mediator of DNA damage Checkpoint 1 (MDC1), a central component of the DNA damage response and a known target of miR-22-3p, displayed decreased expression in AP4-deficient cells. Accordingly, MDC1 was directly induced by AP4 and indirectly by AP4-mediated repression of miR-22-3p. Adenomas and organoids from Ap4-deficient APCmin/+ mice displayed conservation of these regulations. Inhibition of miR-22-3p or ectopic MDC1 expression reversed the increased senescence, DNA damage, CIN and defective HR observed in AP4-deficient CRC cells. AP4-deficiency also sensitized CRC cells to 5-FU treatment, whereas ectopic AP4 conferred resistance to 5-FU in a miR-22-3p and MDC1-dependent manner. In summary, AP4, miR-22-3p and MDC1 form a conserved and coherent, regulatory feed-forward loop to promote DNA repair, which suppresses DNA damage, senescence and CIN, and contributes to 5-FU resistance. These findings explain how elevated AP4 expression contributes to development and chemo-resistance of colorectal cancer after c-MYC activation.

中文翻译：

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AP4 通过诱导 MDC1/DNA 损伤检查点 1 的介质和抑制 MIR22HG/miR-22-3p 来抑制 DNA 损伤、染色体不稳定性和衰老

AP4 (TFAP4) 编码一个基本的螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链 (bHLH-LZ) 转录因子，是致癌转录因子 c-MYC 的直接靶基因。在这里，我们着手确定 AP4 在人类结直肠癌 (CRC) 细胞中的相关性。采用 CRISPR/Cas9 方法生成具有 c-MYC 可诱导表达的 AP4 缺陷型 CRC 细胞系。集落形成、β-gal 染色、免疫荧光、彗星和同源重组 (HR) 测定以及 RNA-Seq 分析用于确定 AP4 失活的影响。进行 qPCR 和 qChIP 分析以验证差异表达的 AP4 目标。对来自 CRC 队列的表达数据进行生物信息学分析。免疫组织化学用于评估体内 AP4 靶标。分析 Ap4 缺陷型 APCmin/+ 小鼠以确定保守性。免疫荧光、染色体和微核计数、MTT 和集落形成测定用于确定 AP4 失活和靶基因调控对染色体不稳定性 (CIN) 和药物敏感性的影响。CRC 细胞系中 AP4 的失活导致自发和 c-MYC 诱导的 DNA 损伤、染色体不稳定性 (CIN) 和细胞衰老增加。AP4 缺陷细胞显示长非编码 RNA MIR22HG 的表达增加，该 RNA MIR22HG 编码 miR-22-3p 并被 AP4 直接抑制。此外，DNA 损伤检查点 1 (MDC1) 的介质是 DNA 损伤反应的中心成分和 miR-22-3p 的已知靶标，在 AP4 缺陷细胞中表现出降低的表达。因此，MDC1 由 AP4 直接诱导，并由 AP4 介导的 miR-22-3p 抑制间接诱导。来自 Ap4 缺陷 APCmin/+ 小鼠的腺瘤和类器官显示出这些规定的保守性。抑制 miR-22-3p 或异位 MDC1 表达逆转了在 AP4 缺陷型 CRC 细胞中观察到的衰老增加、DNA 损伤、CIN 和缺陷 HR。AP4 缺陷也使 CRC 细胞对 5-FU 治疗敏感，而异位 AP4 以 miR-22-3p 和 MDC1 依赖性方式赋予对 5-FU 的抗性。综上所述，AP4、miR-22-3p 和 MDC1 形成一个保守的、连贯的、调节性的前馈环来促进 DNA 修复，从而抑制 DNA 损伤、衰老和 CIN，并有助于 5-FU 抗性。这些发现解释了 c-MYC 激活后 AP4 表达升高如何促进结直肠癌的发展和化学抗性。抑制 miR-22-3p 或异位 MDC1 表达逆转了在 AP4 缺陷型 CRC 细胞中观察到的衰老增加、DNA 损伤、CIN 和缺陷 HR。AP4 缺陷也使 CRC 细胞对 5-FU 治疗敏感，而异位 AP4 以 miR-22-3p 和 MDC1 依赖性方式赋予对 5-FU 的抗性。综上所述，AP4、miR-22-3p 和 MDC1 形成一个保守的、连贯的、调节性的前馈环来促进 DNA 修复，从而抑制 DNA 损伤、衰老和 CIN，并有助于 5-FU 抗性。这些发现解释了 c-MYC 激活后 AP4 表达升高如何促进结直肠癌的发展和化学抗性。抑制 miR-22-3p 或异位 MDC1 表达逆转了在 AP4 缺陷型 CRC 细胞中观察到的衰老增加、DNA 损伤、CIN 和缺陷 HR。AP4 缺陷也使 CRC 细胞对 5-FU 治疗敏感，而异位 AP4 以 miR-22-3p 和 MDC1 依赖性方式赋予对 5-FU 的抗性。综上所述，AP4、miR-22-3p 和 MDC1 形成一个保守的、连贯的、调节性的前馈环来促进 DNA 修复，从而抑制 DNA 损伤、衰老和 CIN，并有助于 5-FU 抗性。这些发现解释了 c-MYC 激活后 AP4 表达升高如何促进结直肠癌的发展和化学抗性。而异位 AP4 以 miR-22-3p 和 MDC1 依赖性方式赋予对 5-FU 的抗性。综上所述，AP4、miR-22-3p 和 MDC1 形成一个保守的、连贯的、调节性的前馈环来促进 DNA 修复，从而抑制 DNA 损伤、衰老和 CIN，并有助于 5-FU 抗性。这些发现解释了 c-MYC 激活后 AP4 表达升高如何促进结直肠癌的发展和化学抗性。而异位 AP4 以 miR-22-3p 和 MDC1 依赖性方式赋予对 5-FU 的抗性。综上所述，AP4、miR-22-3p 和 MDC1 形成一个保守的、连贯的、调节性的前馈环来促进 DNA 修复，从而抑制 DNA 损伤、衰老和 CIN，并有助于 5-FU 抗性。这些发现解释了 c-MYC 激活后 AP4 表达升高如何促进结直肠癌的发展和化学抗性。