The RBR E3 ligase parkin is recruited to the outer mitochondrial membrane (OMM) during oxidative stress where it becomes activated and ubiquitinates numerous proteins. Parkin activation involves binding of a phosphorylated ubiquitin (pUb), followed by phosphorylation of the Ubl domain in parkin, both mediated by the OMM kinase, PINK1. How an OMM protein is selected for ubiquitination is unclear. Parkin targeted OMM proteins have little structural or sequence similarity, with the commonality between substrates being proximity to the OMM. Here, we used chimeric proteins, tagged with ubiquitin (Ub), to evaluate parkin ubiquitination of mitochondrial acceptor proteins pre-ligated to Ub. We find that pUb tethered to the mitochondrial target proteins, Miro1 or CISD1, is necessary for parkin recruitment and essential for target protein ubiquitination. Surprisingly, phosphorylation of parkin is not necessary for the ubiquitination of either Miro1 or CISD1. Thus, parkin lacking its Ubl domain efficiently ubiquitinates a substrate tethered to pUb. Instead, phosphorylated parkin appears to stimulate free Ub chain formation. We also demonstrate that parkin ubiquitination of pUb-tethered substrates occurs on the substrate, rather than the pUb modification. We propose divergent parkin mechanisms whereby parkin-mediated ubiquitination of acceptor proteins is driven by binding to pre-existing pUb on the OMM protein and subsequent parkin phosphorylation triggers free Ub chain formation. This finding accounts for the broad spectrum of OMM proteins ubiquitinated by parkin and has implications on target design for therapeutics.

中文翻译：

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不同的磷酸化信号驱动受体与 parkin 靶向游离泛素链

RBR E3 连接酶 parkin 在氧化应激过程中被募集到线粒体外膜 (OMM)，在此它被激活并泛素化多种蛋白质。Parkin 激活涉及磷酸化泛素 (pUb) 的结合，然后是 parkin 中 Ubl 结构域的磷酸化，两者均由 OMM 激酶 PINK1 介导。如何选择 OMM 蛋白进行泛素化尚不清楚。Parkin 靶向 OMM 蛋白几乎没有结构或序列相似性，底物之间的共性接近 OMM。在这里，我们使用带有泛素 (Ub) 标记的嵌合蛋白来评估与 Ub 预连接的线粒体受体蛋白的帕金泛素化。我们发现与线粒体靶蛋白 Miro1 或 CISD1 相连的 pUb 是 parkin 募集所必需的，也是靶蛋白泛素化所必需的。令人惊讶的是，Miro1 或 CISD1 的泛素化不需要 parkin 的磷酸化。因此，缺乏 Ubl 结构域的 parkin 可以有效地泛素化与 pUb 相连的底物。相反，磷酸化的 parkin 似乎会刺激游离 Ub 链的形成。我们还证明了 pUb 束缚底物的 parkin 泛素化发生在底物上，而不是 pUb 修饰。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。对于 Miro1 或 CISD1 的泛素化，parkin 的磷酸化不是必需的。因此，缺乏 Ubl 结构域的 parkin 可以有效地泛素化与 pUb 相连的底物。相反，磷酸化的 parkin 似乎会刺激游离 Ub 链的形成。我们还证明了 pUb 束缚底物的 parkin 泛素化发生在底物上，而不是 pUb 修饰。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。对于 Miro1 或 CISD1 的泛素化，parkin 的磷酸化不是必需的。因此，缺乏 Ubl 结构域的 parkin 可以有效地泛素化与 pUb 相连的底物。相反，磷酸化的 parkin 似乎会刺激游离 Ub 链的形成。我们还证明了 pUb 束缚底物的 parkin 泛素化发生在底物上，而不是 pUb 修饰。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。缺乏 Ubl 结构域的 parkin 可以有效地泛素化与 pUb 相连的底物。相反，磷酸化的 parkin 似乎会刺激游离 Ub 链的形成。我们还证明了 pUb 束缚底物的 parkin 泛素化发生在底物上，而不是 pUb 修饰。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。缺乏 Ubl 结构域的 parkin 可以有效地泛素化与 pUb 相连的底物。相反，磷酸化的 parkin 似乎会刺激游离 Ub 链的形成。我们还证明了 pUb 束缚底物的 parkin 泛素化发生在底物上，而不是 pUb 修饰。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。而不是 pub 修改。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。而不是 pub 修改。我们提出了不同的 parkin 机制，其中 parkin 介导的受体蛋白泛素化是通过与 OMM 蛋白上预先存在的 pUb 结合来驱动的，随后的 parkin 磷酸化触发游离 Ub 链的形成。这一发现解释了广泛的由 parkin 泛素化的 OMM 蛋白，并对治疗的靶标设计产生了影响。