Peptide transporter 2 (PepT2) transports short peptides from the blood into bovine mammary epithelial cells (BMEC) to stimulate milk protein synthesis. Despite the fact that the effect of PepT2 is acknowledged in BMEC, little is known about its regulation. This study was completed to investigate the role of mammalian target of the rapamycin (mTOR) signaling in regulating the expression and function of PepT2 in BMEC. The regulation of PepT2 by mTOR in BMEC was studied in vitro using peptide transport assay, gene silencing, Western blot. The membrane expression of PepT2 and the uptake of β-Ala-Lys-N-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (β-Ala-Lys-AMCA), a model dipeptide, in BMEC were reduced by rapamycin (a mTOR inhibitor) and silencing of either mTOR complex 1 (mTORC1) or mTOR complex 2 (mTORC2), stimulated by DEP domain-containing mTOR-interacting protein (DEPTOR, endogenous inhibitor of mTORC1 and mTORC2) silencing. The trafficking of PepT2 to the membrane and the uptake of β-Ala-Lys-AMCA was promoted by neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4 isoform 2 (Nedd4-2) silencing. The effects of knockdown of mTORC1, but not mTORC2, on cell membrane expression and transport activity of PepT2 was abolished by Nedd4-2 silencing. With immunofluorescence staining, PepT2 was identified to be interacting with Nedd4-2. The Nedd4-2 expression and the interaction between PepT2 and Nedd4-2 was increased through mTORC1 knockdown, indicating an increased ubiquitination of PepT2. The results revealed that mTORC1 can regulate the expression and function of PepT2 through Nedd4-2 in BMEC.

肽转运蛋白 2 (PepT2) 将短肽从血液转运到牛乳腺上皮细胞 (BMEC) 以刺激乳蛋白合成。尽管 PepT2 的作用在 BMEC 中得到承认，但对其调节知之甚少。本研究旨在研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信号在调节 BMEC 中 PepT2 的表达和功能中的作用。使用肽转运测定、基因沉默、蛋白质印迹在体外研究了 mTOR 在 BMEC 中对 PepT2 的调节。雷帕霉素降低了 BMEC 中 PepT2 的膜表达和 β-Ala-Lys-N-7-amino-4-methylcoumarin-3-乙酸 (β-Ala-Lys-AMCA)（一种模型二肽）的吸收。 mTOR 抑制剂）和 mTOR 复合物 1 (mTORC1) 或 mTOR 复合物 2 (mTORC2) 的沉默，由含有 DEP 结构域的 mTOR 相互作用蛋白（DEPTOR，mTORC1 和 mTORC2 的内源性抑制剂）沉默刺激。神经元前体细胞表达发育下调的 4 同工型 2 (Nedd4-2) 沉默促进了 PepT2 向膜的运输和 β-Ala-Lys-AMCA 的摄取。通过 Nedd4-2 沉默消除了 mTORC1 而不是 mTORC2 对细胞膜表达和 PepT2 转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。mTORC1 和 mTORC2 的内源性抑制剂）沉默。神经元前体细胞表达发育下调的 4 同工型 2 (Nedd4-2) 沉默促进了 PepT2 向膜的运输和 β-Ala-Lys-AMCA 的摄取。通过 Nedd4-2 沉默消除了 mTORC1 而不是 mTORC2 对细胞膜表达和 PepT2 转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。mTORC1 和 mTORC2 的内源性抑制剂）沉默。神经元前体细胞表达发育下调的 4 同工型 2 (Nedd4-2) 沉默促进了 PepT2 向膜的运输和 β-Ala-Lys-AMCA 的摄取。通过 Nedd4-2 沉默消除了 mTORC1 而不是 mTORC2 对细胞膜表达和 PepT2 转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。神经元前体细胞表达发育下调的 4 同工型 2 (Nedd4-2) 沉默促进了 PepT2 向膜的运输和 β-Ala-Lys-AMCA 的摄取。通过 Nedd4-2 沉默消除了 mTORC1 而不是 mTORC2 对细胞膜表达和 PepT2 转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。神经元前体细胞表达发育下调的 4 同工型 2 (Nedd4-2) 沉默促进了 PepT2 向膜的运输和 β-Ala-Lys-AMCA 的摄取。通过 Nedd4-2 沉默消除了 mTORC1 而不是 mTORC2 对细胞膜表达和 PepT2 转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。Nedd4-2 沉默消除了 PepT2 对细胞膜表达和转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。Nedd4-2 沉默消除了 PepT2 对细胞膜表达和转运活性的影响。通过免疫荧光染色，鉴定出 PepT2 与 Nedd4-2 相互作用。通过 mTORC1 敲低，Nedd4-2 表达和 PepT2 和 Nedd4-2 之间的相互作用增加，表明 PepT2 泛素化增加。结果表明，mTORC1可以通过Nedd4-2在BMEC中调节PepT2的表达和功能。