Due to fast relaxation processes of transition metal ions, electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy of metalloproteins needs to be performed at cryogenic temperatures. To avoid damaging the biological system upon freezing, a cryoprotectant is generally added to the sample as a glassing agent. Even though cryoprotectants are expected to be inert substances, evidences in literature show their non-innocent role in altering the shape of EPR spectra of proteins and biological objects in general. In this work we conduct a systematic study on the impact of several experimental factors—such as buffer composition, choice of cryoprotectant, pH and temperature—on the EPR spectrum of myoglobin, taken as a reference system for being a well-characterized heme-containing protein. We focus on high-pH buffers to induce and investigate the alkaline transition of ferric myoglobin (pKa ~ 8.9). A combined approach of continuous-wave EPR and UV–visible absorption spectroscopy shows that using particular pairs of buffers and cryoprotectants determines a considerable pH variation in the sample and that this effect is enhanced at cryogenic temperature. In addition, phase memory times were measured to evaluate the efficiency of different cryoprotectants and compared with spectral linewidths in continuous-wave EPR. Our findings suggest that among the selected cryoprotectants ethylene glycol is rather effective, even more than the widely used glycerol, without having unwanted effects.

由于过渡金属离子的快速弛豫过程，金属蛋白的电子顺磁共振 (EPR) 光谱需要在低温下进行。为了避免在冷冻时损坏生物系统，通常会在样品中添加冷冻保护剂作为玻璃化剂。尽管预计冷冻保护剂是惰性物质，但文献中的证据表明，它们在改变蛋白质和生物物体的 EPR 光谱形状方面发挥着非无辜的作用。在这项工作中，我们对几个实验因素（如缓冲液成分、冷冻保护剂的选择、pH 和温度）对肌红蛋白 EPR 谱的影响进行了系统研究，将其作为参考系统作为具有良好特征的含血红素的参考系统。蛋白质。我们专注于高 pH 缓冲液，以诱导和研究三价铁肌红蛋白 (pKa ~ 8.9) 的碱性转变。连续波 EPR 和紫外-可见吸收光谱的组合方法表明，使用特定的缓冲液和冷冻保护剂对决定了样品中相当大的 pH 值变化，并且这种影响在低温下会增强。此外，测量相位记忆时间以评估不同冷冻保护剂的效率，并与连续波 EPR 中的光谱线宽进行比较。我们的研究结果表明，在选定的冷冻保护剂中，乙二醇相当有效，甚至比广泛使用的甘油更有效，而且不会产生不良影响。连续波 EPR 和紫外-可见吸收光谱的组合方法表明，使用特定的缓冲液和冷冻保护剂对决定了样品中相当大的 pH 值变化，并且这种影响在低温下会增强。此外，测量相位记忆时间以评估不同冷冻保护剂的效率，并与连续波 EPR 中的光谱线宽进行比较。我们的研究结果表明，在选定的冷冻保护剂中，乙二醇相当有效，甚至比广泛使用的甘油更有效，而且不会产生不良影响。连续波 EPR 和紫外-可见吸收光谱的组合方法表明，使用特定的缓冲液和冷冻保护剂对决定了样品中相当大的 pH 值变化，并且这种影响在低温下会增强。此外，测量相位记忆时间以评估不同冷冻保护剂的效率，并与连续波 EPR 中的光谱线宽进行比较。我们的研究结果表明，在选定的冷冻保护剂中，乙二醇相当有效，甚至比广泛使用的甘油更有效，而且不会产生不良影响。测量相位记忆时间以评估不同冷冻保护剂的效率，并与连续波 EPR 中的光谱线宽进行比较。我们的研究结果表明，在选定的冷冻保护剂中，乙二醇相当有效，甚至比广泛使用的甘油更有效，而且不会产生不良影响。测量相位记忆时间以评估不同冷冻保护剂的效率，并与连续波 EPR 中的光谱线宽进行比较。我们的研究结果表明，在选定的冷冻保护剂中，乙二醇相当有效，甚至比广泛使用的甘油更有效，而且不会产生不良影响。