CRISPR-based forward genetic screening represents a powerful approach for the systematic characterization of gene function. Recent efforts have been directed toward establishing CRISPR-based tools for the programmable delivery of combinatorial genetic perturbations, most of which are mediated by a single nuclease and the expression of structurally identical guide backbones from two promoters. In contrast, we have developed CHyMErA (Cas hybrid for multiplexed editing and screening applications), which is based on the co-expression of Cas9 and Cas12a nucleases in conjunction with a hybrid guide RNA (hgRNA) engineered by the fusion of Cas9 and Cas12a guides and expressed from a single U6 promoter. CHyMErA is suitable for the high-throughput deletion of genetic segments including the excision of individual exons. Furthermore, CHyMErA enables the concomitant targeting of two or more genes and can thus be used for the systematic mapping of genetic interactions in mammalian cells. CHyMErA can also be applied for the perturbation of paralogous gene pairs, thereby allowing the capturing of phenotypic roles that would otherwise be masked because of genetic redundancy. Here, we provide instructions for the cloning of hgRNA screening libraries and individual hgRNA constructs and offer guidelines for designing and performing combinatorial pooled genetic screens using CHyMErA. Starting with the generation of Cas9- and Cas12a-expressing cell lines, CHyMErA screening can be implemented within 15–20 weeks.

基于 CRISPR 的正向遗传筛选代表了一种对基因功能进行系统表征的强大方法。最近的努力旨在建立基于 CRISPR 的工具，用于组合遗传扰动的可编程传递，其中大部分是由单个核酸酶和来自两个启动子的结构相同的指导骨架的表达介导的。相比之下，我们开发了 CHyMErA（Cas hybrid for multiplexed editing and screening applications），它基于 Cas9 和 Cas12a 核酸酶的共表达以及由 Cas9 和 Cas12a 指南融合设计的杂交指南 RNA (hgRNA)并从单个 U6 启动子表达。CHyMErA 适用于高通量基因片段缺失，包括单个外显子的切除。此外，CHyMErA 能够同时靶向两个或多个基因，因此可用于哺乳动物细胞中遗传相互作用的系统绘图。CHyMErA 也可用于扰动旁系同源基因对，从而允许捕获表型角色，否则这些角色会因遗传冗余而被掩盖。在这里，我们提供有关克隆 hgRNA 筛选文库和单个 hgRNA 构建体的说明，并提供使用 CHyMErA 设计和执行组合汇集遗传筛选的指南。从生成 Cas9 和 Cas12a 表达细胞系开始，CHyMErA 筛选可在 15-20 周内实施。CHyMErA 也可用于扰动旁系同源基因对，从而允许捕获表型角色，否则这些角色会因遗传冗余而被掩盖。在这里，我们提供有关克隆 hgRNA 筛选文库和单个 hgRNA 构建体的说明，并提供使用 CHyMErA 设计和执行组合汇集遗传筛选的指南。从生成 Cas9 和 Cas12a 表达细胞系开始，CHyMErA 筛选可在 15-20 周内实施。CHyMErA 也可用于扰动旁系同源基因对，从而允许捕获表型角色，否则这些角色会因遗传冗余而被掩盖。在这里，我们提供有关克隆 hgRNA 筛选文库和单个 hgRNA 构建体的说明，并提供使用 CHyMErA 设计和执行组合汇集遗传筛选的指南。从生成 Cas9 和 Cas12a 表达细胞系开始，CHyMErA 筛选可在 15-20 周内实施。我们提供有关克隆 hgRNA 筛选文库和单个 hgRNA 构建体的说明，并提供使用 CHyMErA 设计和执行组合汇集遗传筛选的指南。从生成 Cas9 和 Cas12a 表达细胞系开始，CHyMErA 筛选可在 15-20 周内实施。我们提供有关克隆 hgRNA 筛选文库和单个 hgRNA 构建体的说明，并提供使用 CHyMErA 设计和执行组合汇集遗传筛选的指南。从生成 Cas9 和 Cas12a 表达细胞系开始，CHyMErA 筛选可在 15-20 周内实施。