Closely related protein families evolved from common ancestral genes present a significant hurdle in developing member- and isoform-specific chemical probes, owing to their similarity in fold and function. In this piece of work, we explore an allele-specific chemical rescue strategy to activate a “dead” variant of a wildtype protein using synthetic cofactors and demonstrate its successful application to the members of the alpha-ketoglutarate (αKG)-dependent histone demethylase 4 (KDM4) family. We show that a mutation at a specific residue in the catalytic site renders the variant inactive toward the natural cosubstrate. In contrast, αKG derivatives bearing appropriate stereoelectronic features endowed the mutant with native-like demethylase activity while remaining refractory to a set of wild type dioxygenases. The orthogonal enzyme-cofactor pairs demonstrated site- and degree-specific lysine demethylation on a full-length chromosomal histone in the cellular milieu. Our work offers a strategy to modulate a specific histone demethylase by identifying and engineering a conserved phenylalanine residue, which acts as a gatekeeper in the KDM4 subfamily, to sensitize the enzyme toward a novel set of αKG derivatives. The orthogonal pairs developed herein will serve as probes to study the role of degree-specific lysine demethylation in mammalian gene expression. Furthermore, this approach to overcome active site degeneracy is expected to have general application among all human αKG-dependent dioxygenases.

中文翻译：

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使用非生物辅因子对组蛋白去甲基化酶进行等位基因特异性化学拯救

由于它们在折叠和功能上的相似性，从共同祖先基因进化而来的密切相关的蛋白质家族在开发成员特异性和亚型特异性化学探针方面存在重大障碍。在这项工作中，我们探索了一种等位基因特异性化学拯救策略，以使用合成辅助因子激活野生型蛋白质的“死”变体，并证明其成功应用于依赖 α-酮戊二酸 (αKG) 的组蛋白去甲基化酶 4 的成员(KDM4) 家族。我们表明，催化位点中特定残基的突变使变体对天然共底物无活性。相比之下，具有适当立体电子特征的 αKG 衍生物赋予突变体类似天然的去甲基化酶活性，同时对一组野生型双加氧酶保持耐火性。正交酶辅因子对证明了细胞环境中全长染色体组蛋白的位点和程度特异性赖氨酸去甲基化。我们的工作提供了一种策略，通过识别和改造保守的苯丙氨酸残基来调节特定的组蛋白去甲基化酶，该残基充当 KDM4 亚家族中的看门人，使酶对一组新的 αKG 衍生物敏感。本文开发的正交对将用作研究哺乳动物基因表达中度特异性赖氨酸去甲基化作用的探针。此外，这种克服活性位点简并的方法有望在所有人类 αKG 依赖性双加氧酶中得到普遍应用。我们的工作提供了一种策略，通过识别和改造保守的苯丙氨酸残基来调节特定的组蛋白去甲基化酶，该残基充当 KDM4 亚家族中的看门人，使酶对一组新的 αKG 衍生物敏感。本文开发的正交对将用作研究哺乳动物基因表达中度特异性赖氨酸去甲基化作用的探针。此外，这种克服活性位点简并的方法有望在所有人类 αKG 依赖性双加氧酶中得到普遍应用。我们的工作提供了一种策略，通过识别和改造保守的苯丙氨酸残基来调节特定的组蛋白去甲基化酶，该残基充当 KDM4 亚家族中的看门人，使酶对一组新的 αKG 衍生物敏感。本文开发的正交对将用作研究哺乳动物基因表达中度特异性赖氨酸去甲基化作用的探针。此外，这种克服活性位点简并的方法有望在所有人类 αKG 依赖性双加氧酶中得到普遍应用。本文开发的正交对将用作研究哺乳动物基因表达中度特异性赖氨酸去甲基化作用的探针。此外，这种克服活性位点简并的方法有望在所有人类 αKG 依赖性双加氧酶中得到普遍应用。本文开发的正交对将用作研究哺乳动物基因表达中度特异性赖氨酸去甲基化作用的探针。此外，这种克服活性位点简并的方法有望在所有人类 αKG 依赖性双加氧酶中得到普遍应用。