Double-strand break (DSB) repair choice is greatly influenced by the initial processing of DNA ends. 53BP1 limits the formation of recombinogenic single-strand DNA (ssDNA) in BRCA1-deficient cells, leading to defects in homologous recombination (HR). However, the exact mechanisms by which 53BP1 inhibits DSB resection remain unclear. Previous studies have identified two potential pathways: protection against DNA2/EXO1 exonucleases presumably through the Shieldin (SHLD) complex binding to ssDNA, and localized DNA synthesis through the CTC1-STN1-TEN1 (CST) and DNA polymerase α (Polα) to counteract resection. Using a combinatorial approach of END-seq, SAR-seq, and RPA ChIP-seq, we directly assessed the extent of resection, DNA synthesis, and ssDNA, respectively, at restriction enzyme-induced DSBs. We show that, in the presence of 53BP1, Polα-dependent DNA synthesis reduces the fraction of resected DSBs and the resection lengths in G0/G1, supporting a previous model that fill-in synthesis can limit the extent of resection. However, in the absence of 53BP1, Polα activity is sustained on ssDNA yet does not substantially counter resection. In contrast, EXO1 nuclease activity is essential for hyperresection in the absence of 53BP1. Thus, Polα-mediated fill-in partially limits resection in the presence of 53BP1 but cannot counter extensive hyperresection due to the loss of 53BP1 exonuclease blockade. These data provide the first nucleotide mapping of DNA synthesis at resected DSBs and provide insight into the relationship between fill-in polymerases and resection exonucleases.

中文翻译：

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53BP1在DNA断裂末端保护和DNA合成中的作用

双链断裂 (DSB) 修复选择受 DNA 末端初始处理的影响很大。53BP1 限制了 BRCA1 缺陷细胞中重组单链 DNA (ssDNA) 的形成，导致同源重组 (HR) 缺陷。然而，53BP1 抑制 DSB 切除的确切机制仍不清楚。先前的研究已经确定了两种潜在的途径：可能通过与 ssDNA 结合的 Shieldin (SHLD) 复合物保护 DNA2/EXO1 外切核酸酶，以及通过 CTC1-STN1-TEN1 (CST) 和 DNA 聚合酶 α (Polα) 进行局部 DNA 合成以抵消切除. 使用 END-seq、SAR-seq 和 RPA ChIP-seq 的组合方法，我们分别直接评估了限制性内切酶诱导的 DSB 的切除程度、DNA 合成和 ssDNA。我们表明，在 53BP1 存在的情况下，依赖 Polα 的 DNA 合成减少了切除的 DSB 的比例和 G0/G1 的切除长度，支持之前的模型，即填充合成可以限制切除的范围。然而，在没有 53BP1 的情况下，Polα 活性在 ssDNA 上持续存在，但基本上不对抗切除。相反，在没有 53BP1 的情况下，EXO1 核酸酶活性对于过度切除至关重要。因此，在 53BP1 存在的情况下，Polα 介导的填充部分限制了切除，但由于 53BP1 外切核酸酶阻断的丧失，不能对抗广泛的过度切除。这些数据提供了在切除的 DSB 处 DNA 合成的第一个核苷酸图谱，并提供了对填充聚合酶和切除外切核酸酶之间关系的深入了解。支持填充合成可以限制切除范围的先前模型。然而，在没有 53BP1 的情况下，Polα 活性在 ssDNA 上持续存在，但基本上不对抗切除。相反，在没有 53BP1 的情况下，EXO1 核酸酶活性对于过度切除至关重要。因此，在 53BP1 存在的情况下，Polα 介导的填充部分限制了切除，但由于 53BP1 外切核酸酶阻断的丧失，不能对抗广泛的过度切除。这些数据提供了在切除的 DSB 处 DNA 合成的第一个核苷酸图谱，并提供了对填充聚合酶和切除外切核酸酶之间关系的深入了解。支持填充合成可以限制切除范围的先前模型。然而，在没有 53BP1 的情况下，Polα 活性在 ssDNA 上持续存在，但基本上不对抗切除。相反，在没有 53BP1 的情况下，EXO1 核酸酶活性对于过度切除至关重要。因此，在 53BP1 存在的情况下，Polα 介导的填充部分限制了切除，但由于 53BP1 外切核酸酶阻断的丧失，不能对抗广泛的过度切除。这些数据提供了在切除的 DSB 处 DNA 合成的第一个核苷酸图谱，并提供了对填充聚合酶和切除外切核酸酶之间关系的深入了解。在没有 53BP1 的情况下，EXO1 核酸酶活性对于过度切除至关重要。因此，在 53BP1 存在的情况下，Polα 介导的填充部分限制了切除，但由于 53BP1 外切核酸酶阻断的丧失，不能对抗广泛的过度切除。这些数据提供了在切除的 DSB 处 DNA 合成的第一个核苷酸图谱，并提供了对填充聚合酶和切除外切核酸酶之间关系的深入了解。在没有 53BP1 的情况下，EXO1 核酸酶活性对于过度切除至关重要。因此，在 53BP1 存在的情况下，Polα 介导的填充部分限制了切除，但由于 53BP1 外切核酸酶阻断的丧失，不能对抗广泛的过度切除。这些数据提供了在切除的 DSB 处 DNA 合成的第一个核苷酸图谱，并提供了对填充聚合酶和切除外切核酸酶之间关系的深入了解。