p97 protein is a highly conserved, abundant, functionally diverse, structurally dynamic homohexameric AAA enzyme-containing N, D1, and D2 domains. A truncated p97 protein containing the N and D1 domains and the D1–D2 linker (ND1L) exhibits 79% of wild-type (WT) ATPase activity whereas the ND1 domain alone without the linker only has 2% of WT activity. To investigate the relationship between the D1–D2 linker and the D1 domain, we produced p97 ND1L mutants and demonstrated that this 22-residue linker region is essential for D1 ATPase activity. The conserved amino acid leucine 464 (L464) is critical for regulating D1 and D2 ATPase activity by p97 cofactors p37, p47, and Npl4–Ufd1 (NU). Changing leucine to alanine, proline, or glutamate increased the maximum rate of ATP turnover (kcat) of p47-regulated ATPase activities for these mutants, but not for WT. p37 and p47 increased the kcat of the proline substituted linker, suggesting that they induced linker conformations facilitating ATP hydrolysis. NU inhibited D1 ATPase activities of WT and mutant ND1L proteins, but activated D2 ATPase activity of full-length p97. To further understand the mutant mechanism, we used single-particle cryo-EM to visualize the full-length p97L464P and revealed the conformational change of the D1–D2 linker, resulting in a movement of the helix-turn-helix motif (543–569). Taken together with the biochemical and structural results we conclude that the linker helps maintain D1 in a competent conformation and relays the communication to/from the N-domain to the D1 and D2 ATPase domains, which are ∼50 Å away.

中文翻译：

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p97 D1-D2 接头中的保守 L464 对 p97 辅因子调节的 ATPase 活性至关重要

p97 蛋白是一种高度保守、丰富、功能多样、结构动态的同型六聚 AAA 酶，含有 N、D1 和 D2 域。包含 N 和 D1 结构域以及 D1-D2 接头 (ND1L) 的截短 p97 蛋白表现出 79% 的野生型 (WT) ATPase 活性，而单独的 ND1 结构域没有接头仅具有 2% 的 WT 活性。为了研究 D1-D2 接头和 D1 结构域之间的关系，我们生产了 p97 ND1L 突变体，并证明了这个 22 个残基的接头区域对于 D1 ATPase 活性是必不可少的。保守的氨基酸亮氨酸 464 (L464) 对于通过 p97 辅因子 p37、p47 和 Npl4–Ufd1 (NU) 调节 D1 和 D2 ATPase 活性至关重要。将亮氨酸更改为丙氨酸、脯氨酸或谷氨酸会增加这些突变体的 p47 调节的 ATP 酶活性的最大 ATP 转换率 (kcat)，但不适用于 WT。p37 和 p47 增加了脯氨酸取代接头的 kcat，表明它们诱导接头构象促进 ATP 水解。NU 抑制 WT 和突变体 ND1L 蛋白的 D1 ATPase 活性，但激活全长 p97 的 D2 ATPase 活性。为了进一步了解突变机制，我们使用单粒子冷冻电镜来可视化全长 p97L464P 并揭示 D1-D2 接头的构象变化，导致螺旋-转角-螺旋基序（543-569 ）。结合生化和结构结果，我们得出结论，连接子有助于将 D1 维持在合适的构象中，并将与 N 域之间的通信中继到距离约 50 Å 的 D1 和 D2 ATPase 域。表明它们诱导了促进 ATP 水解的接头构象。NU 抑制 WT 和突变体 ND1L 蛋白的 D1 ATPase 活性，但激活全长 p97 的 D2 ATPase 活性。为了进一步了解突变机制，我们使用单粒子冷冻电镜来可视化全长 p97L464P 并揭示 D1-D2 接头的构象变化，导致螺旋-转角-螺旋基序（543-569 ）。结合生化和结构结果，我们得出结论，连接子有助于将 D1 维持在合适的构象中，并将与 N 域之间的通信中继到距离约 50 Å 的 D1 和 D2 ATPase 域。表明它们诱导了促进 ATP 水解的接头构象。NU 抑制 WT 和突变体 ND1L 蛋白的 D1 ATPase 活性，但激活全长 p97 的 D2 ATPase 活性。为了进一步了解突变机制，我们使用单粒子冷冻电镜来可视化全长 p97L464P 并揭示 D1-D2 接头的构象变化，导致螺旋-转角-螺旋基序（543-569 ）。结合生化和结构结果，我们得出结论，连接子有助于将 D1 维持在合适的构象中，并将与 N 域之间的通信中继到距离约 50 Å 的 D1 和 D2 ATPase 域。为了进一步了解突变机制，我们使用单粒子冷冻电镜来可视化全长 p97L464P 并揭示 D1-D2 接头的构象变化，导致螺旋-转角-螺旋基序（543-569 ）。结合生化和结构结果，我们得出结论，连接子有助于将 D1 维持在合适的构象中，并将与 N 域之间的通信中继到距离约 50 Å 的 D1 和 D2 ATPase 域。为了进一步了解突变机制，我们使用单粒子冷冻电镜来可视化全长 p97L464P 并揭示 D1-D2 接头的构象变化，导致螺旋-转角-螺旋基序（543-569 ）。结合生化和结构结果，我们得出结论，连接子有助于将 D1 维持在合适的构象中，并将与 N 域之间的通信中继到距离约 50 Å 的 D1 和 D2 ATPase 域。