LysO, a prototypical member of the LysO family, mediates export of L-lysine (Lys) and resistance to the toxic Lys antimetabolite, L-thialysine (Thl) in Escherichia coli. Here, we have addressed unknown aspects of LysO function pertaining to its membrane topology and the mechanism by which it mediates Lys/Thl export. Using substituted cysteine (Cys) accessibility, here we delineated the membrane topology of LysO. Our studies support a model in which both the N- and C-termini of LysO are present at the periplasmic face of the membrane with a transmembrane (TM) domain comprising eight TM segments (TMSs) between them. In addition, a feature of intramembrane solvent exposure in LysO is inferred with the identification of membrane-located solvent-exposed Cys residues. Isosteric substitutions of a pair of conserved acidic residues, one E233, located in the solvent-exposed TMS7 and the other D261, in a solvent-exposed intramembrane segment located between TMS7 and TMS8, abolished LysO function in vivo. Thl, but not Lys, elicited proton release in inside-out membrane vesicles, a process requiring the presence of both E233 and D261. We postulate that Thl may be exported in antiport with H+ and that Lys may be a low-affinity export substrate. Our findings are compatible with a physiological scenario wherein in vivo LysO exports the naturally occurring antimetabolite Thl with higher affinity over the essential cellular metabolite Lys, thus affording protection from Thl toxicity and limiting wasteful export of Lys.

中文翻译：

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L-赖氨酸出口蛋白 LysO 的拓扑分析揭示了一对保守的膜内溶剂暴露酸性残基的关键作用。

LysO 是 LysO 家族的典型成员，介导 L-赖氨酸 (Lys) 的输出和对大肠杆菌中有毒的 Lys 抗代谢物 L-硫赖氨酸 (Thl) 的抗性。在这里，我们解决了 LysO 功能的未知方面，涉及其膜拓扑结构及其介导 Lys/Thl 输出的机制。使用取代的半胱氨酸 (Cys) 可及​​性，我们在这里描绘了 LysO 的膜拓扑结构。我们的研究支持一个模型，其中 LysO 的 N 端和 C 端都存在于膜的周质面上，跨膜 (TM) 域在它们之间包含八个 TM 片段 (TMS)。此外，LysO 中膜内溶剂暴露的一个特征是通过鉴定膜定位的溶剂暴露的 Cys 残基来推断的。一对保守酸性残基的等排置换，一个 E233，位于溶剂暴露的 TMS7 和另一个 D261，在位于 TMS7 和 TMS8 之间的溶剂暴露的膜内部分，在体内消除了 LysO 功能。Thl，但不是 Lys，在由内而外的膜囊泡中引发质子释放，这一过程需要 E233 和 D261 的存在。我们假设 Thl 可能与 H+ 逆向输出，Lys 可能是低亲和力输出底物。我们的发现与生理情况相符，其中体内 LysO 输出天然存在的抗代谢物 Thl，其亲和力高于必需的细胞代谢物 Lys，从而提供保护免受 Thl 毒性并限制 Lys 的浪费性输出。在由内向外的膜囊泡中引发质子释放，这一过程需要 E233 和 D261 的存在。我们假设 Thl 可能与 H+ 逆向输出，Lys 可能是低亲和力输出底物。我们的发现与生理情况相符，其中体内 LysO 输出天然存在的抗代谢物 Thl，其亲和力高于必需的细胞代谢物 Lys，从而提供保护免受 Thl 毒性并限制 Lys 的浪费性输出。在由内向外的膜囊泡中引发质子释放，这一过程需要 E233 和 D261 的存在。我们假设 Thl 可能与 H+ 逆向输出，Lys 可能是低亲和力输出底物。我们的发现与生理情况相符，其中体内 LysO 输出天然存在的抗代谢物 Thl，其亲和力高于必需的细胞代谢物 Lys，从而提供保护免受 Thl 毒性并限制 Lys 的浪费性输出。