ABSTRACT

Non-canonical autophagy pathways decorate single-membrane vesicles with Atg8-family proteins such as MAP1LC3/LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3). Phagosomes containing the bacterial pathogen Listeria monocytogenes (L.m.) can be targeted by a non-canonical autophagy pathway called LC3-associated phagocytosis (LAP), which substantially contributes to the anti-listerial activity of macrophages and immunity. We here characterized a second non-canonical autophagy pathway targeting L.m.-containing phagosomes, which is induced by damage caused to the phagosomal membrane by the pore-forming toxin of L.m., listeriolysin O. This pore-forming toxin-induced non-canonical autophagy pathway (PINCA) was the only autophagic pathway evoked in tissue macrophages deficient for the NADPH oxidase CYBB/NOX2 that produces the reactive oxygen species (ROS) that are required for LAP induction. Similarly, also bone marrow-derived macrophages (BMDM) exclusively targeted L.m. by PINCA as they completely failed to induce LAP because of insufficient production of ROS through CYBB, in part, due to low expression of some CYBB complex subunits. Priming of BMDM with proinflammatory cytokines such as TNF and IFNG/IFNγ increased ROS production by CYBB and endowed them with the ability to target L.m. by LAP. Targeting of L.m. by LAP remained relatively rare, though, preventing LAP from substantially contributing to the anti-listerial activity of BMDM. Similar to LAP, the targeting of L.m.-containing phagosomes by PINCA promoted their fusion with lysosomes. Surprisingly, however, this did not substantially contribute to anti-listerial activity of BMDM. Thus, in contrast to LAP, PINCA does not have clear anti-listerial function suggesting that the two different non-canonical autophagy pathways targeting L.m. may have discrete functions.

Abbreviations: actA/ActA: actin assembly-inducing protein A; ATG: autophagy-related; BMDM: Bone marrow-derived macrophages; CALCOCO2/NDP52: calcium-binding and coiled-coil domain-containing protein 2; CYBA/p22phox: cytochrome b-245 light chain; CYBB/NOX2: cytochrome b(558) subunit beta; E. coli: Escherichia coli; IFNG/IFNγ: interferon gamma; L.m.: Listeria monocytogenes; LAP: LC3-associated phagocytosis; LGALS: galectin; LLO: listeriolysin O; MAP1LC3/LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3; NCF1/p47phox: neutrophil cytosol factor 1; NCF2/p67phox: neutrophil cytosol factor 2; NCF4/p67phox: neutrophil cytosol factor 4; Peritoneal macrophages: PM; PINCA: pore-forming toxin-induced non-canonical autophagy; plc/PLC: 1-phosphatidylinositol phosphodiesterase; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; RB1CC1/FIP200: RB1-inducible coiled-coil protein 1; ROS: reactive oxygen species; S. aureus: Staphylococcus aureus; S. flexneri: Shigella flexneri; SQSTM1/p62: sequestosome 1; S. typhimurium: Salmonella typhimurium; T3SS: type III secretion system; TNF: tumor necrosis factor; ULK: unc-51 like autophagy activating kinase; PM: peritoneal macrophages; WT: wild type.

摘要

非经典自噬途径用 Atg8 家族蛋白如 MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白 1 轻链 3）修饰单膜囊泡。含有细菌病原体李斯特菌的吞噬体(Lm) 可以被称为 LC3 相关吞噬作用 (LAP) 的非经典自噬途径靶向，这在很大程度上有助于巨噬细胞的抗李斯特菌活性和免疫。我们在此表征了第二种靶向含 Lm 的吞噬体的非经典自噬途径，该途径是由 Lm 的成孔毒素李斯特菌溶血素 O 对吞噬体膜造成的损伤诱导的。这种成孔毒素诱导的非经典自噬途径(PINCA) 是唯一在组织巨噬细胞中诱发的自噬途径，该途径缺乏 NADPH 氧化酶 CYBB/NOX2，可产生 LAP 诱导所需的活性氧 (ROS)。同样，骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）也专门针对 PINCA 的 Lm，因为它们完全不能诱导 LAP，因为通过 CYBB 产生的 ROS 不足，部分原因是某些 CYBB 复合亚基的低表达。用促炎细胞因子如 TNF 和 IFNG/IFNγ 启动 BMDM 会增加 CYBB 产生的 ROS，并赋予它们通过 LAP 靶向 Lm 的能力。然而，LAP 对 Lm 的靶向仍然相对罕见，这阻止了 LAP 对 BMDM 的抗李斯特菌活性的实质性贡献。与 LAP 类似，PINCA 靶向含 Lm 的吞噬体促进了它们与溶酶体的融合。然而，令人惊讶的是，这并没有显着促进 BMDM 的抗李斯特菌活性。因此，与 LAP 相比，PINCA 没有明确的抗李斯特菌功能，这表明靶向 Lm 的两种不同的非经典自噬途径可能具有不同的功能。用促炎细胞因子如 TNF 和 IFNG/IFNγ 启动 BMDM 会增加 CYBB 产生的 ROS，并赋予它们通过 LAP 靶向 Lm 的能力。然而，LAP 对 Lm 的靶向仍然相对罕见，这阻止了 LAP 对 BMDM 的抗李斯特菌活性的实质性贡献。与 LAP 类似，PINCA 靶向含 Lm 的吞噬体促进了它们与溶酶体的融合。然而，令人惊讶的是，这并没有显着促进 BMDM 的抗李斯特菌活性。因此，与 LAP 相比，PINCA 没有明确的抗李斯特菌功能，这表明靶向 Lm 的两种不同的非经典自噬途径可能具有不同的功能。用促炎细胞因子如 TNF 和 IFNG/IFNγ 启动 BMDM 会增加 CYBB 产生的 ROS，并赋予它们通过 LAP 靶向 Lm 的能力。然而，LAP 对 Lm 的靶向仍然相对罕见，这阻止了 LAP 对 BMDM 的抗李斯特菌活性的实质性贡献。与 LAP 类似，PINCA 靶向含 Lm 的吞噬体促进了它们与溶酶体的融合。然而，令人惊讶的是，这并没有显着促进 BMDM 的抗李斯特菌活性。因此，与 LAP 相比，PINCA 没有明确的抗李斯特菌功能，这表明靶向 Lm 的两种不同的非经典自噬途径可能具有不同的功能。然而，LAP 仍然相对罕见，这阻止了 LAP 对 BMDM 的抗李斯特菌活性的实质性贡献。与 LAP 类似，PINCA 靶向含 Lm 的吞噬体促进了它们与溶酶体的融合。然而，令人惊讶的是，这并没有显着促进 BMDM 的抗李斯特菌活性。因此，与 LAP 相比，PINCA 没有明确的抗李斯特菌功能，这表明靶向 Lm 的两种不同的非经典自噬途径可能具有不同的功能。然而，LAP 仍然相对罕见，这阻止了 LAP 对 BMDM 的抗李斯特菌活性的实质性贡献。与 LAP 类似，PINCA 靶向含 Lm 的吞噬体促进了它们与溶酶体的融合。然而，令人惊讶的是，这并没有显着促进 BMDM 的抗李斯特菌活性。因此，与 LAP 相比，PINCA 没有明确的抗李斯特菌功能，这表明靶向 Lm 的两种不同的非经典自噬途径可能具有不同的功能。

缩写：actA/ActA：肌动蛋白组装诱导蛋白 A；ATG：自噬相关；BMDM：骨髓来源的巨噬细胞；CALCOCO2/NDP52：钙结合和卷曲螺旋结构域蛋白 2；CYBA/p22phox：细胞色素 b-245 轻链；CYBB/NOX2：细胞色素 b(558) 亚基 β；大肠杆菌：大肠杆菌；IFNG/IFNγ：干扰素γ；Lm：单核细胞增生李斯特菌; LAP：LC3相关的吞噬作用；LGALS：半乳糖凝集素；LLO：李斯特菌溶血素O；MAP1LC3/LC3：微管相关蛋白 1 轻链 3；NCF1/p47phox：中性粒细胞溶质因子 1；NCF2/p67phox：中性粒细胞溶质因子 2；NCF4/p67phox：中性粒细胞溶质因子 4；腹腔巨噬细胞：PM；PINCA：成孔毒素诱导的非典型自噬；plc/PLC：1-磷脂酰肌醇磷酸二酯酶；PMA：佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯；RB1CC1/FIP200：RB1 诱导型卷曲螺旋蛋白 1；ROS：活性氧；金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌；S. 福氏：福氏志贺氏菌；SQSTM1/p62：隔离体 1；鼠伤寒沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌; T3SS：III型分泌系统；TNF：肿瘤坏死因子；ULK：unc-51 样自噬激活激酶；PM：腹腔巨噬细胞；WT：野生型。