ABSTRACT

Epidermal growth factor (EGF)-nanoparticle conjugates have the potential for cancer therapeutics due to the unique cytotoxic activity in cancer cells with EGF receptor (EGFR) overexpression. To gain its maximum activity, the EGF molecule should be immobilized on the nanoparticle surface in a defined orientation so as the bulky nanoparticle will not interfere EGF-EGFR interaction. Herein, we demonstrate successful enhancement of the anti-cancer activity of EGF-gold nanoparticle conjugates (EGF-GNPs) by controlling the EGF orientation on the surface of the nanoparticle through site-specific mutagenesis. Three lysine-free EGF variants (RR, RS, and SR) were designed, where two endogenous lysine residues were replaced with either arginine (R) or serine (S). The EGF mutants can be conjugated to the GNPs in a controlled orientation through the single amino group at the N-terminus. The ability of the mutants to induce extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation was no different from wild type EGF (WT) in soluble form, rather lowered for one mutant (RR). However, after conjugated to GNPs, the SR mutants exhibited an enhanced biological activity than WT, in terms of ERK phosphorylation and growth inhibition of cancer cells. Further analysis of the binding constant of each mutant indicated the emergent enhanced activity of the GNP conjugates of the SR mutant was not solely contributed to the orientation, but to its higher binding activity to EGFR. These results validate the present genetic recombination strategy to improve the anticancer efficiency of EGF-GNPs.

摘要

由于在 EGF 受体 (EGFR) 过度表达的癌细胞中具有独特的细胞毒活性，表皮生长因子 (EGF)-纳米颗粒偶联物具有用于癌症治疗的潜力。为了获得最大活性，EGF 分子应该以特定方向固定在纳米颗粒表面，这样庞大的纳米颗粒不会干扰 EGF-EGFR 相互作用。在此，我们证明了通过位点特异性诱变控制纳米颗粒表面上的 EGF 方向，成功增强了 EGF-金纳米颗粒缀合物（EGF-GNPs）的抗癌活性。设计了三种不含赖氨酸的 EGF 变体（RR、RS 和 SR），其中两个内源性赖氨酸残基被替换为精氨酸 (R) 或丝氨酸 (S)。EGF 突变体可以通过 N 端的单个氨基以受控方向与 GNP 缀合。突变体诱导细胞外信号调节激酶 (ERK) 磷酸化的能力与可溶性形式的野生型 EGF (WT) 没有什么不同，而对于一种突变体 (RR) 而言则降低了。然而，在与 GNP 结合后，SR 突变体在 ERK 磷酸化和癌细胞生长抑制方面表现出比 WT 增强的生物活性。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。突变体诱导细胞外信号调节激酶 (ERK) 磷酸化的能力与可溶性形式的野生型 EGF (WT) 没有什么不同，而对于一种突变体 (RR) 而言则降低了。然而，在与 GNP 结合后，SR 突变体在 ERK 磷酸化和癌细胞生长抑制方面表现出比 WT 增强的生物活性。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。突变体诱导细胞外信号调节激酶 (ERK) 磷酸化的能力与可溶性形式的野生型 EGF (WT) 没有什么不同，而对于一种突变体 (RR) 而言则降低了。然而，在与 GNP 结合后，SR 突变体在 ERK 磷酸化和癌细胞生长抑制方面表现出比 WT 增强的生物活性。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。对于一个突变体 (RR) 来说反而降低了。然而，在与 GNP 结合后，SR 突变体在 ERK 磷酸化和癌细胞生长抑制方面表现出比 WT 增强的生物活性。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。对于一个突变体 (RR) 来说反而降低了。然而，在与 GNP 结合后，SR 突变体在 ERK 磷酸化和癌细胞生长抑制方面表现出比 WT 增强的生物活性。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。对每个突变体的结合常数的进一步分析表明，SR 突变体的 GNP 缀合物的新兴增强活性不仅有助于定向，而且还有助于其对 EGFR 的更高结合活性。这些结果验证了目前提高 EGF-GNP 抗癌效率的基因重组策略。