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Nanomolar, noncovalent antagonism of hedgehog cholesterolysis: exception to the “irreversibility rule” for protein autoprocessing inhibition
bioRxiv - Biochemistry Pub Date : 2021-09-02 , DOI: 10.1101/2021.09.01.458638 Andrew George Wagner , Robert T. Stagnitta , Zihan Xu , John Pezzullo , Nabin Kandel , Douglas F Covey , Jose-Luis Giner , Chunyu Wang , Brian P. Callahan
bioRxiv - Biochemistry Pub Date : 2021-09-02 , DOI: 10.1101/2021.09.01.458638 Andrew George Wagner , Robert T. Stagnitta , Zihan Xu , John Pezzullo , Nabin Kandel , Douglas F Covey , Jose-Luis Giner , Chunyu Wang , Brian P. Callahan
Hedgehog (Hh) signaling ligands undergo carboxy terminal sterylation through specialized autoprocessing, called cholesterolysis. Sterylation is brought about intramolecularly in a single turn-over by an enzymatic domain, called HhC. HhC is found in precursor Hh proteins only. Through cholesterolysis, HhC is cleaved from the precursor. Attempts to identify molecules that inhibit intramolecular cleavage/sterylation activity of HhC have resulted in antagonists that bind HhC irreversibly through covalent mechanisms, as is commonplace for protein autoprocessing inhibitors. Here we report an exception to the “irreversibility rule” for protein autoprocessing inhibition. Using a FRET-based activity assay for HhC, we screened a focused library of sterol-like analogs for HhC cholesterolysis inhibitors. We identified and validated four structurally related noncovalent inhibitors, which were then used for SAR studies. The most effective derivative, tBT-HBT, binds HhC reversibly with an IC50 of 300 nM. An allosteric binding site for tBT-HBT, encompassing interactions from the two subdomains of HhC, is suggested by kinetic analysis, mutagenesis studies, and photoaffinity labeling. A striking resemblance is found between the inhibitors described here and a family of noncovalent, allosteric activators of HhC, which we described previously. The inhibitor/activator duality appears to be mediated by the same allosteric site, which displays sensitivity to subtle differences in the structure of a heterocycle substituent on the effector molecule.
中文翻译:
纳摩尔,刺猬胆固醇分解的非共价拮抗作用:蛋白质自动加工抑制的“不可逆规则”的例外
Hedgehog (Hh) 信号配体通过专门的自动处理进行羧基末端立体化,称为胆固醇分解。Sterylation 是由称为 HhC 的酶促结构域在单次转换中在分子内引起的。HhC 仅存在于前体 Hh 蛋白中。通过胆固醇分解,HhC 从前体中分离出来。试图识别抑制 HhC 的分子内裂解/立体化活性的分子已经导致拮抗剂通过共价机制不可逆地结合 HhC,这对于蛋白质自动加工抑制剂来说是司空见惯的。在这里,我们报告了蛋白质自动加工抑制的“不可逆规则”的一个例外。我们使用基于 FRET 的 HhC 活性测定,筛选了 HhC 胆固醇分解抑制剂的类固醇类似物的重点库。我们确定并验证了四种结构相关的非共价抑制剂,然后将其用于 SAR 研究。最有效的衍生物 tBT-HBT 可通过 IC 可逆地结合 HhC50的 300 nM。动力学分析、诱变研究和光亲和标记表明 tBT-HBT 的变构结合位点包括来自 HhC 的两个子域的相互作用。在此处描述的抑制剂与我们之前描述的 HhC的非共价变构激活剂家族之间发现了惊人的相似之处。抑制剂/激活剂二元性似乎是由相同的变构位点介导的,这对效应分子上杂环取代基结构的细微差异表现出敏感性。
更新日期:2021-09-04
中文翻译:
纳摩尔,刺猬胆固醇分解的非共价拮抗作用:蛋白质自动加工抑制的“不可逆规则”的例外
Hedgehog (Hh) 信号配体通过专门的自动处理进行羧基末端立体化,称为胆固醇分解。Sterylation 是由称为 HhC 的酶促结构域在单次转换中在分子内引起的。HhC 仅存在于前体 Hh 蛋白中。通过胆固醇分解,HhC 从前体中分离出来。试图识别抑制 HhC 的分子内裂解/立体化活性的分子已经导致拮抗剂通过共价机制不可逆地结合 HhC,这对于蛋白质自动加工抑制剂来说是司空见惯的。在这里,我们报告了蛋白质自动加工抑制的“不可逆规则”的一个例外。我们使用基于 FRET 的 HhC 活性测定,筛选了 HhC 胆固醇分解抑制剂的类固醇类似物的重点库。我们确定并验证了四种结构相关的非共价抑制剂,然后将其用于 SAR 研究。最有效的衍生物 tBT-HBT 可通过 IC 可逆地结合 HhC50的 300 nM。动力学分析、诱变研究和光亲和标记表明 tBT-HBT 的变构结合位点包括来自 HhC 的两个子域的相互作用。在此处描述的抑制剂与我们之前描述的 HhC的非共价变构激活剂家族之间发现了惊人的相似之处。抑制剂/激活剂二元性似乎是由相同的变构位点介导的,这对效应分子上杂环取代基结构的细微差异表现出敏感性。