In vitro assessment of mutagenicity is an essential component in the chemical risk assessment. Given the diverse modes of action by which chemicals can induce DNA damage, it is essential that these in vitro assays are carefully evaluated for their possibilities and limitations. In this study, we used a fluorescent protein HepG2 reporter test system in combination with high content imaging. To measure induction of the DNA damage response (DDR), we used three different green fluorescent protein reporters for p53 pathway activation. These allowed for accurate quantification of p53, p21 and BTG2 (BTG anti-proliferation factor 2) protein expression and cell viability parameters at a single cell or spheroid resolution. The reporter lines were cultured as 2D monolayers and as 3D spheroids. Furthermore, liver maturity and cytochrome P450 enzyme expression were increased by culturing in an amino acid-rich (AAGLY) medium. We found that culture conditions that support a sustained proliferative state (2D culturing with normal DMEM medium) give superior sensitivity when genotoxic compounds are tested that do not require metabolisation and of which the mutagenic mode of action is dependent on replication. For compounds, which are metabolically converted to mutagenic metabolites, more differentiated HepG2 DDR reporters (e.g. 3D cultures) showed a higher sensitivity. This study stratifies how different culture methods of HepG2 DDR reporter cells can influence the sensitivity towards diverse genotoxicants and how this provides opportunities for a tiered genotoxicity testing strategy.

中文翻译：

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使用基于图像的 2D 和 3D HepG2 DNA 损伤反应荧光蛋白报告基因实现先进的基因毒性测试策略

致突变性的体外评估是化学品风险评估的重要组成部分。鉴于化学物质可以诱导 DNA 损伤的多种作用模式，必须仔细评估这些体外测定的可能性和局限性。在这项研究中，我们使用了荧光蛋白 HepG2 报告基因测试系统与高内涵成像相结合。为了测量 DNA 损伤反应 (DDR) 的诱导，我们使用了三种不同的绿色荧光蛋白报告基因来激活 p53 通路。这些允许在单个细胞或球体分辨率下准确量化 p53、p21 和 BTG2（BTG 抗增殖因子 2）蛋白质表达和细胞活力参数。报告线被培养为 2D 单层和 3D 球体。此外，通过在富含氨基酸的 (AAGLY) 培养基中培养，肝脏成熟度和细胞色素 P450 酶的表达增加。我们发现，当测试不需要代谢且诱变作用模式依赖于复制的基因毒性化合物时，支持持续增殖状态的培养条件（使用正常 DMEM 培养基进行 2D 培养）具有出色的灵敏度。对于代谢转化为诱变代谢物的化合物，分化程度更高的 HepG2 DDR 报告基因（例如 3D 培养物）显示出更高的灵敏度。本研究对 HepG2 DDR 报告细胞的不同培养方法如何影响对不同基因毒物的敏感性进行分层，以及这如何为分层基因毒性测试策略提供机会。我们发现，当测试不需要代谢且诱变作用模式依赖于复制的基因毒性化合物时，支持持续增殖状态的培养条件（使用正常 DMEM 培养基进行 2D 培养）具有出色的灵敏度。对于代谢转化为诱变代谢物的化合物，分化程度更高的 HepG2 DDR 报告基因（例如 3D 培养物）显示出更高的灵敏度。本研究对 HepG2 DDR 报告细胞的不同培养方法如何影响对不同基因毒物的敏感性进行分层，以及这如何为分层基因毒性测试策略提供机会。我们发现，当测试不需要代谢且诱变作用模式依赖于复制的基因毒性化合物时，支持持续增殖状态的培养条件（使用正常 DMEM 培养基进行 2D 培养）具有出色的灵敏度。对于代谢转化为诱变代谢物的化合物，分化程度更高的 HepG2 DDR 报告基因（例如 3D 培养物）显示出更高的灵敏度。本研究对 HepG2 DDR 报告细胞的不同培养方法如何影响对不同基因毒物的敏感性进行分层，以及这如何为分层基因毒性测试策略提供机会。