Plant RNA viruses form organized membrane-bound replication complexes to replicate their genomes. This process requires virus- and host-encoded proteins and leads to the production of double-stranded RNA (dsRNA) replication intermediates. Here, we describe the use of Arabidopsis thaliana expressing GFP-tagged dsRNA-binding protein (B2:GFP) to pull down dsRNA and associated proteins in planta upon infection with Tobacco rattle virus (TRV). Mass spectrometry analysis of the dsRNA-B2:GFP-bound proteins from infected plants revealed the presence of viral proteins and numerous host proteins. Among a selection of nine host candidate proteins, eight showed relocalization upon infection, and seven of these colocalized with B2-labeled TRV replication complexes. Infection of A. thaliana T-DNA mutant lines for eight such factors revealed that genetic knockout of dsRNA-BINDING PROTEIN 2 (DRB2) leads to increased TRV accumulation and DRB2 overexpression caused a decrease in the accumulation of four different plant RNA viruses, indicating that DRB2 has a potent and wide-ranging antiviral activity. We propose B2:GFP-mediated pull down of dsRNA to be a versatile method to explore virus replication complex proteomes and to discover key host virus replication factors. Given the universality of dsRNA, development of this tool holds great potential to investigate RNA viruses in other host organisms.

中文翻译：

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dsRNA 结合蛋白的免疫捕获提供了对烟草响尾病毒复制复合物的深入了解，并揭示拟南芥 DRB2 是一种广谱抗病毒效应物

植物 RNA 病毒形成有组织的膜结合复制复合物来复制它们的基因组。该过程需要病毒和宿主编码的蛋白质，并导致产生双链 RNA (dsRNA) 复制中间体。在这里，我们描述了使用拟南芥表达 GFP 标记的 dsRNA 结合蛋白 (B2:GFP) 在感染烟草响尾病毒 (TRV) 后在植物中拉下 dsRNA 和相关蛋白。来自受感染植物的 dsRNA-B2:GFP 结合蛋白的质谱分析揭示了病毒蛋白和许多宿主蛋白的存在。在九种宿主候选蛋白的选择中，八种在感染后显示重新定位，其中七种与 B2 标记的 TRV 复制复合物共定位。A.感染 八种此类因子的拟南芥 T-DNA 突变系表明，dsRNA-BINDING PROTEIN 2 (DRB2) 的基因敲除导致 TRV 积累增加，DRB2 过表达导致四种不同植物 RNA 病毒的积累减少，表明 DRB2 具有强效和广泛的抗病毒活性。我们建议 B2:GFP 介导的 dsRNA 下拉作为探索病毒复制复杂蛋白质组和发现关键宿主病毒复制因子的通用方法。鉴于 dsRNA 的普遍性，该工具的开发具有研究其他宿主生物中的 RNA 病毒的巨大潜力。表明 DRB2 具有强效和广泛的抗病毒活性。我们建议 B2:GFP 介导的 dsRNA 下拉作为探索病毒复制复杂蛋白质组和发现关键宿主病毒复制因子的通用方法。鉴于 dsRNA 的普遍性，该工具的开发具有研究其他宿主生物中的 RNA 病毒的巨大潜力。表明 DRB2 具有强效和广泛的抗病毒活性。我们建议 B2:GFP 介导的 dsRNA 下拉作为探索病毒复制复杂蛋白质组和发现关键宿主病毒复制因子的通用方法。鉴于 dsRNA 的普遍性，该工具的开发具有研究其他宿主生物中的 RNA 病毒的巨大潜力。