Vector-borne pathogens, such as Bourbon virus (BRBV), Heartland virus (HRTV), West Nile virus (WNV), and Trypanosoma cruzi (TCZ) are a great threat to public health and animal health. We developed a panel of TaqMan real-time PCR assays for pathogen surveillance. PCR targets were selected based on nucleic acid sequences deposited in GenBank. Primers and probes were either designed de novo or selected from publications. The coverages and specificities of the primers and probes were extensively evaluated by performing BLAST searches. Synthetic DNA or RNA fragments (gBlocks) were used as PCR templates in initial assay development and PCR positive controls in subsequent assay validation. For operational efficiency, the same thermocycling profile was used in BRBV, HRTV, and WNV reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assays, and a similar thermocycling profile without the initial reverse-transcription step was used in TCZ qPCR. The assays were optimized by titrating primer and probe concentrations. The analytical sensitivities were 100, 100, 10, and 10 copies of gBlock per reaction for BRBV (Cq = 36.0 ± 0.7), HRTV (Cq = 36.6 ± 0.9), WNV (Cq = 35.5 ± 0.4), and TCZ (Cq = 38.8 ± 0.3), respectively. PCR sensitivities for vector genomic DNA or RNA spiked with gBlock reached 100, 100, 10, and 10 copies per reaction for BRBV, HRTV, WNV, and TCZ, respectively. PCR specificity evaluated against a panel of non-target pathogens showed no significant cross-reactivity. Our BRBV, HRTV, WNV, and TCZ PCR panel could support epidemiologic studies and pathogen surveillance.

媒介传播的病原体，例如波旁病毒 (BRBV)、心脏地带病毒 (HRTV)、西尼罗河病毒 (WNV) 和克氏锥虫(TCZ) 对公共卫生和动物健康构成巨大威胁。我们开发了一组用于病原体监测的 TaqMan 实时 PCR 检测。基于保存在 GenBank 中的核酸序列选择 PCR 目标。引物和探针要么是从头设计的，要么是从出版物中选择的。通过执行 BLAST 搜索，广泛评估了引物和探针的覆盖范围和特异性。合成 DNA 或 RNA 片段 (gBlocks) 在初始测定开发中用作 PCR 模板，在随后的测定验证中用作 PCR 阳性对照。为了提高操作效率，在 BRBV、HRTV 和 WNV 逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 分析中使用了相同的热循环曲线，在 TCZ qPCR 中使用了类似的没有初始逆转录步骤的热循环曲线。通过滴定引物和探针浓度优化测定。对于 BRBV (Cq = 36.0 ± 0.7)、HRTV (Cq = 36.6 ± 0.9)、WNV (Cq = 35.5 ± 0.4) 和 TCZ (Cq = 38.8 ± 0.3)，分别。对于 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ，每个反应中添加 gBlock 的载体基因组 DNA 或 RNA 的 PCR 敏感性分别达到 100、100、10 和 10 个拷贝。针对一组非目标病原体评估的 PCR 特异性显示没有显着的交叉反应性。我们的 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ PCR 面板可以支持流行病学研究和病原体监测。3），分别。对于 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ，每个反应中添加 gBlock 的载体基因组 DNA 或 RNA 的 PCR 敏感性分别达到 100、100、10 和 10 个拷贝。针对一组非目标病原体评估的 PCR 特异性显示没有显着的交叉反应性。我们的 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ PCR 面板可以支持流行病学研究和病原体监测。3），分别。对于 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ，每个反应中添加 gBlock 的载体基因组 DNA 或 RNA 的 PCR 敏感性分别达到 100、100、10 和 10 个拷贝。针对一组非目标病原体评估的 PCR 特异性显示没有显着的交叉反应性。我们的 BRBV、HRTV、WNV 和 TCZ PCR 面板可以支持流行病学研究和病原体监测。