The Y-family DNA polymerase η (Polη) is critical for the synthesis past damaged DNA nucleotides in yeast through translesion DNA synthesis (TLS). TLS is initiated by monoubiquitination of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and the subsequent recruitment of TLS polymerases. Although individual structures of the Polη catalytic core and PCNA have been solved, a high-resolution structure of the complex of Polη/PCNA or Polη/monoubiquitinated PCNA (Ub-PCNA) still remains elusive, partly due to the disordered Polη C-terminal region and the flexibility of ubiquitin on PCNA. To circumvent these obstacles and obtain structural insights into this important TLS polymerase complex, we developed photo-activatable PCNA and Ub-PCNA probes containing a p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa) crosslinker at selected positions on PCNA. By photo-crosslinking the probes with full-length Polη, specific crosslinking sites were identified following tryptic digestion and tandem mass spectrometry analysis. We discovered direct interactions of the Polη catalytic core and its C-terminal region with both sides of the PCNA ring. Model building using the crosslinking site information as a restraint revealed multiple conformations of Polη in the polymerase complex. Availability of the photo-activatable PCNA and Ub-PCNA probes will also facilitate investigations into other PCNA-containing complexes important for DNA replication, repair and damage tolerance.

中文翻译：

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光激活 Ub-PCNA 探针揭示了酿酒酵母 Polη/PCNA 复合物的新结构特征

Y 家族 DNA 聚合酶 η (Polη) 对于酵母中通过跨损伤 DNA 合成 (TLS) 合成过去受损 DNA 核苷酸至关重要。TLS 由增殖细胞核抗原 (PCNA) 的单泛素化和随后的 TLS 聚合酶募集启动。尽管 Polη 催化核心和 PCNA 的个别结构已得到解决，但 Polη/PCNA 或 Polη/单泛素化 PCNA (Ub-PCNA) 复合物的高分辨率结构仍然难以捉摸，部分原因是无序的 Polη C-末端区域以及泛素在 PCNA 上的灵活性。为了规避这些障碍并获得对这一重要 TLS 聚合酶复合物的结构洞察，我们开发了光激活 PCNA 和 Ub-PCNA 探针，该探针在 PCNA 的选定位置含有对苯甲酰基-L-苯丙氨酸 (pBpa) 交联剂。通过将探针与全长 Polη 进行光交联，在胰蛋白酶消化和串联质谱分析后确定了特定的交联位点。我们发现了 Polη 催化核心及其 C 端区域与 PCNA 环两侧的直接相互作用。使用交联位点信息作为约束的模型构建揭示了聚合酶复合物中 Polη 的多种构象。光激活 PCNA 和 Ub-PCNA 探针的可用性也将有助于研究对 DNA 复制、修复和损伤耐受性很重要的其他含 PCNA 的复合物。我们发现了 Polη 催化核心及其 C 端区域与 PCNA 环两侧的直接相互作用。使用交联位点信息作为约束的模型构建揭示了聚合酶复合物中 Polη 的多种构象。光激活 PCNA 和 Ub-PCNA 探针的可用性也将有助于研究对 DNA 复制、修复和损伤耐受性很重要的其他含 PCNA 的复合物。我们发现了 Polη 催化核心及其 C 端区域与 PCNA 环两侧的直接相互作用。使用交联位点信息作为约束的模型构建揭示了聚合酶复合物中 Polη 的多种构象。光激活 PCNA 和 Ub-PCNA 探针的可用性也将有助于研究对 DNA 复制、修复和损伤耐受性很重要的其他含 PCNA 的复合物。