In vitro models based on brain capillary endothelial cells (BCECs) are among the most versatile tools in blood–brain barrier research for testing drug penetration into the brain and how this is affected by efflux transporters such as P-glycoprotein (Pgp). However, compared to freshly isolated brain capillaries or primary BCECs, the expression of Pgp in immortalized BCEC lines is markedly lower, which prompted us previously to transduce the widely used human BCEC line hCMEC/D3 with a doxycycline-inducible MDR1-EGFP fusion plasmid. The EGFP-labeled Pgp in these cells allows studying the localization and trafficking of the transporter and how these processes are affected by drug exposure. Here we used this strategy for the rat BCEC line RBE4 and performed a face-to-face comparison of RBE4 and hCMEC/D3 wild-type (WT) and MDR1-EGFP transduced cells. MDR1-EGFP-transduced variants were derived from WT cells by lentiviral transduction, using an MDR1-linker-EGFP vector. Localization, trafficking, and function of Pgp were compared in WT and MDR1-EGFP transduced cell lines. Primary cultures of rat BCECs and freshly isolated rat brain capillaries were used for comparison. All cells exhibited typical BCEC morphology. However, significant differences were observed in the localization of Pgp in that RBE4-MDR1-EGFP cells expressed Pgp primarily at the plasma membrane, whereas in hCMEC/D3 cells, the Pgp-EGFP fusion protein was visible both at the plasma membrane and in endolysosomal vesicles. Exposure to doxorubicin increased the number of Pgp-EGFP-positive endolysosomes, indicating a lysosomotropic effect. Furthermore, lysosomal trapping of doxorubicin was observed, likely contributing to the protection of the cell nucleus from damage. In cocultures of WT and MDR1-EGFP transduced cells, intercellular Pgp-EGFP trafficking was observed in RBE4 cells as previously reported for hCMEC/D3 cells. Compared to WT cells, the MDR1-EGFP transduced cells exhibited a significantly higher expression and function of Pgp. However, the junctional tightness of WT and MDR1-EGFP transduced RBE4 and hCMEC/D3 cells was markedly lower than that of primary BCECs, excluding the use of the cell lines for studying vectorial drug transport. The present data indicate that MDR1-EGFP transduced RBE4 cells are an interesting tool to study the biogenesis of lysosomes and Pgp-mediated lysosomal drug trapping in response to chemotherapeutic agents and other compounds at the level of the blood–brain barrier.

中文翻译：

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MDR1-EGFP转导大鼠与人脑毛细血管内皮细胞系中P-糖蛋白定位、运输和功能的异同

基于脑毛细血管内皮细胞 (BCECs) 的体外模型是血脑屏障研究中最通用的工具之一，用于测试药物对大脑的渗透以及外排转运蛋白如 P-糖蛋白 (Pgp) 对其的影响。然而，与新鲜分离的脑毛细血管或原代 BCEC 相比，Pgp 在永生化 BCEC 系中的表达明显较低，这促使我们之前用强力霉素诱导的 MDR1-EGFP 融合质粒转导广泛使用的人类 BCEC 系 hCMEC/D3。这些细胞中 EGFP 标记的 Pgp 允许研究转运蛋白的定位和运输以及这些过程如何受到药物暴露的影响。在这里，我们将这种策略用于大鼠 BCEC 系 RBE4，并对 RBE4 和 hCMEC/D3 野生型 (WT) 和 MDR1-EGFP 转导细胞进行了面对面的比较。MDR1-EGFP 转导的变体来自 WT 细胞，通过慢病毒转导，使用 MDR1-接头-EGFP 载体。在 WT 和 MDR1-EGFP 转导的细胞系中比较了 Pgp 的定位、运输和功能。大鼠 BCECs 和新鲜分离的大鼠脑毛细血管的原代培养物用于比较。所有细胞都表现出典型的BCEC形态。然而，在 Pgp 的定位中观察到显着差异，因为 RBE4-MDR1-EGFP 细胞主要在质膜上表达 Pgp，而在 hCMEC/D3 细胞中，Pgp-EGFP 融合蛋白在质膜和内溶酶体中均可见囊泡。暴露于多柔比星增加了 Pgp-EGFP 阳性内溶酶体的数量，表明溶酶体作用。此外，观察到多柔比星的溶酶体捕获，可能有助于保护细胞核免受损伤。在 WT 和 MDR1-EGFP 转导细胞的共培养中，在 RBE4 细胞中观察到细胞间 Pgp-EGFP 运输，如先前报道的 hCMEC/D3 细胞。与 WT 细胞相比，MDR1-EGFP 转导的细胞表现出显着更高的 Pgp 表达和功能。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。在 WT 和 MDR1-EGFP 转导细胞的共培养中，在 RBE4 细胞中观察到细胞间 Pgp-EGFP 运输，如先前报道的 hCMEC/D3 细胞。与 WT 细胞相比，MDR1-EGFP 转导的细胞表现出显着更高的 Pgp 表达和功能。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。在 WT 和 MDR1-EGFP 转导细胞的共培养中，在 RBE4 细胞中观察到细胞间 Pgp-EGFP 运输，如先前报道的 hCMEC/D3 细胞。与 WT 细胞相比，MDR1-EGFP 转导的细胞表现出显着更高的 Pgp 表达和功能。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。如先前报道的 hCMEC/D3 细胞，在 RBE4 细胞中观察到细胞间 Pgp-EGFP 运输。与 WT 细胞相比，MDR1-EGFP 转导的细胞表现出显着更高的 Pgp 表达和功能。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。如先前报道的 hCMEC/D3 细胞，在 RBE4 细胞中观察到细胞间 Pgp-EGFP 运输。与 WT 细胞相比，MDR1-EGFP 转导的细胞表现出显着更高的 Pgp 表达和功能。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。然而，WT 和 MDR1-EGFP 转导的 RBE4 和 hCMEC/D3 细胞的连接紧密度明显低于原代 BCEC，不包括使用细胞系研究载体药物转运。目前的数据表明，MDR1-EGFP 转导的 RBE4 细胞是研究溶酶体的生物发生和 Pgp 介导的溶酶体药物在血脑屏障水平对化疗剂和其他化合物的反应的有趣工具。