Apoptosis is a regulated form of cell death essential to the removal of unwanted cells. At its core, a family of cysteine peptidases named caspases cleave key proteins allowing cell death to occur. To do so, each caspase catalytic pocket recognizes preferred amino acid sequences resulting in proteolysis, but some also use exosites to select and cleave important proteins efficaciously. Such exosites have been found in a few caspases, notably caspase-7 that has a lysine patch (K38KKK) that binds RNA, which acts as a bridge to RNA-binding proteins favoring proximity between the peptidase and its substrates resulting in swifter cleavage. Although caspase-7 interaction with RNA has been identified, in-depth characterization of this interaction is lacking. In this study, using in vitro cleavage assays, we determine that RNA concentration and length affect the cleavage of RNA-binding proteins. Additionally, using binding assays and RNA sequencing, we found that caspase-7 binds RNA molecules regardless of their type, sequence, or structure. Moreover, we demonstrate that the N-terminal peptide of caspase-7 reduces the affinity of the peptidase for RNA, which translates into slower cleavages of RNA-binding proteins. Finally, employing engineered heterodimers, we show that a caspase-7 dimer can use both exosites simultaneously to increase its affinity to RNA because a heterodimer with only one exosite has reduced affinity for RNA and cleavage efficacy. These findings shed light on a mechanism that furthers substrate recognition by caspases and provides potential insight into its regulation during apoptosis.

中文翻译：

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caspase-7 与 RNA 相互作用的表征

细胞凋亡是一种受调控的细胞死亡形式，对于去除不需要的细胞至关重要。在其核心，一个名为 caspase 的半胱氨酸肽酶家族会裂解关键蛋白质，从而导致细胞死亡。为此，每个半胱天冬酶催化口袋都会识别导致蛋白水解的首选氨基酸序列，但有些还使用外来位点来有效地选择和切割重要的蛋白质。已经在一些 caspase 中发现了这种外位点，特别是 caspase-7，它具有结合 RNA 的赖氨酸贴片 (K38KKK)，它充当连接 RNA 结合蛋白的桥梁，有利于肽酶与其底物之间的接近，从而导致更快的切割。尽管已经确定了 caspase-7 与 RNA 的相互作用，但缺乏对这种相互作用的深入表征。在这项研究中，使用体外裂解试验，我们确定 RNA 浓度和长度会影响 RNA 结合蛋白的切割。此外，使用结合测定和 RNA 测序，我们发现 caspase-7 与 RNA 分子结合，无论其类型、序列或结构如何。此外，我们证明了 caspase-7 的 N 端肽降低了肽酶对 RNA 的亲和力，这转化为 RNA 结合蛋白的裂解速度较慢。最后，使用工程化的异源二聚体，我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两个外部位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外部位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。此外，使用结合测定和 RNA 测序，我们发现 caspase-7 与 RNA 分子结合，无论其类型、序列或结构如何。此外，我们证明了 caspase-7 的 N 端肽降低了肽酶对 RNA 的亲和力，这转化为 RNA 结合蛋白的裂解速度较慢。最后，使用工程化的异源二聚体，我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两个外部位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外部位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。此外，使用结合测定和 RNA 测序，我们发现 caspase-7 与 RNA 分子结合，无论其类型、序列或结构如何。此外，我们证明了 caspase-7 的 N 端肽降低了肽酶对 RNA 的亲和力，这转化为 RNA 结合蛋白的裂解速度较慢。最后，使用工程化的异源二聚体，我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两个外部位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外部位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。或结构。此外，我们证明了 caspase-7 的 N 端肽降低了肽酶对 RNA 的亲和力，这转化为 RNA 结合蛋白的裂解速度较慢。最后，使用工程化的异源二聚体，我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两个外部位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外部位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。或结构。此外，我们证明了 caspase-7 的 N 端肽降低了肽酶对 RNA 的亲和力，这转化为 RNA 结合蛋白的裂解速度较慢。最后，使用工程化的异源二聚体，我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两个外部位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外部位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两种外切位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外切位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。我们表明 caspase-7 二聚体可以同时使用两种外切位点来增加其对 RNA 的亲和力，因为只有一个外切位点的异源二聚体对 RNA 的亲和力和切割效率降低。这些发现揭示了一种机制，该机制进一步促进了半胱天冬酶对底物的识别，并为其在细胞凋亡过程中的调节提供了潜在的洞察力。