The power of the CRISPR/Cas9 system has revolutionized genome editing in many fields of biology. These applications have expanded exponentially over recent years, including those regarding protein expression technologies. The CRISPR/Cas9 system avoids random integration of the gene of interest and due to this characteristic can be exploited to obtain a stable cell line for the high-yield expression of recombinant proteins. Here we propose a method to edit a hybridoma cell line for the constitutive expression of proteins of interest using the CRISPR/Cas9 system. First, with the scope of optimizing the method, we replaced part of the light chain of immunoglobulin with the Green Fluorescent Protein (GFP) gene, obtaining a precise knock-in in the hybridoma genome. We confirmed the expression and secretion of GFP into the culture medium via fluorimetric analysis, as well as correct genome editing by RNA sequencing. Then, using the same approach, we included the gene encoding a protein of diagnostic interest, the Bovine Herpesvirus 1 glycoprotein E, in the donor DNA. We obtained a stable clone able to secrete gE protein in fusion with GFP into the culture medium. This result was confirmed by ELISA and Western Blot analysis. This study confirms the suitability of this cell line for the production of proteins of diagnostic interest by stable gene expression in a mammalian system. These experiments will enable the technique to be developed from its proof of concept to more specific applications in the field of infectious disease diagnostics.

CRISPR/Cas9 系统的强大功能彻底改变了许多生物学领域的基因组编辑。近年来，这些应用呈指数增长，包括与蛋白质表达技术有关的应用。CRISPR/Cas9 系统避免了目标基因的随机整合，因此可以利用这一特性获得稳定的细胞系，用于重组蛋白的高产表达。在这里，我们提出了一种使用 CRISPR/Cas9 系统编辑杂交瘤细胞系以组成型表达目标蛋白质的方法。首先，在优化方法的范围内，我们将部分免疫球蛋白轻链替换为绿色荧光蛋白（GFP）基因，在杂交瘤基因组中获得了精确的knock-in。我们通过荧光分析证实了 GFP 在培养基中的表达和分泌，以及通过 RNA 测序进行正确的基因组编辑。然后，使用相同的方法，我们在供体 DNA 中包含了编码具有诊断意义的蛋白质的基因，即牛疱疹病毒 1 糖蛋白 E。我们获得了一个稳定的克隆，能够将与 GFP 融合的 gE 蛋白分泌到培养基中。该结果通过ELISA和蛋白质印迹分析得到证实。该研究证实了该细胞系通过在哺乳动物系统中的稳定基因表达来生产具有诊断意义的蛋白质的适用性。这些实验将使该技术能够从其概念验证发展到传染病诊断领域的更具体应用。使用相同的方法，我们在供体 DNA 中包含了编码具有诊断意义的蛋白质的基因，即牛疱疹病毒 1 糖蛋白 E。我们获得了一个稳定的克隆，能够将与 GFP 融合的 gE 蛋白分泌到培养基中。该结果通过ELISA和蛋白质印迹分析得到证实。该研究证实了该细胞系通过在哺乳动物系统中的稳定基因表达来生产具有诊断意义的蛋白质的适用性。这些实验将使该技术能够从其概念验证发展到传染病诊断领域的更具体应用。使用相同的方法，我们在供体 DNA 中包含了编码具有诊断意义的蛋白质的基因，即牛疱疹病毒 1 糖蛋白 E。我们获得了一个稳定的克隆，能够将与 GFP 融合的 gE 蛋白分泌到培养基中。该结果通过ELISA和蛋白质印迹分析得到证实。该研究证实了该细胞系通过在哺乳动物系统中的稳定基因表达来生产具有诊断意义的蛋白质的适用性。这些实验将使该技术能够从其概念验证发展到传染病诊断领域的更具体应用。我们获得了一个稳定的克隆，能够将与 GFP 融合的 gE 蛋白分泌到培养基中。该结果通过ELISA和蛋白质印迹分析得到证实。该研究证实了该细胞系通过在哺乳动物系统中的稳定基因表达来生产具有诊断意义的蛋白质的适用性。这些实验将使该技术能够从其概念验证发展到传染病诊断领域的更具体应用。我们获得了一个稳定的克隆，能够将与 GFP 融合的 gE 蛋白分泌到培养基中。该结果通过ELISA和蛋白质印迹分析得到证实。该研究证实了该细胞系通过在哺乳动物系统中的稳定基因表达来生产具有诊断意义的蛋白质的适用性。这些实验将使该技术能够从其概念验证发展到传染病诊断领域的更具体应用。