3D correlative microscopy methods have revolutionized biomedical research, allowing the acquisition of multidimensional information to gain an in-depth understanding of biological systems. With the advent of relevant cryo-preservation methods, correlative imaging of cryogenically preserved samples has led to nanometer resolution imaging (2–50 nm) under harsh imaging regimes such as electron and soft X-ray tomography. These methods have now been combined with conventional and super-resolution fluorescence imaging at cryogenic temperatures to augment information content from a given sample, resulting in the immediate requirement for protocols that facilitate hassle-free, unambiguous cross-correlation between microscopes. We present here sample preparation strategies and a direct comparison of different working fiducialization regimes that facilitate 3D correlation of cryo-structured illumination microscopy and cryo-soft X-ray tomography. Our protocol has been tested at two synchrotron beamlines (B24 at Diamond Light Source in the UK and BL09 Mistral at ALBA in Spain) and has led to the development of a decision aid that facilitates experimental design with the strategic use of markers based on project requirements. This protocol takes between 1.5 h and 3.5 d to complete, depending on the cell populations used (adherent cells may require several days to grow on sample carriers).

3D 相关显微镜方法彻底改变了生物医学研究，允许获取多维信息以深入了解生物系统。随着相关低温保存方法的出现，低温保存样品的相关成像已导致在电子和软 X 射线断层扫描等苛刻成像条件下实现纳米分辨率成像（2-50 nm）。这些方法现在已与低温下的常规和超分辨率荧光成像相结合，以增加给定样品的信息内容，从而迫切需要促进显微镜之间无忧、明确互相关的协议。我们在此介绍样品制备策略，并直接比较不同的工作基准化机制，这些机制有助于低温结构照明显微镜和低温软 X 射线断层扫描的 3D 相关性。我们的协议已在两条同步加速器光束线（英国 Diamond Light Source 的 B24 和西班牙 ALBA 的 BL09 Mistral）上进行了测试，并导致开发了一种决策辅助工具，该辅助工具可根据项目要求通过战略性使用标记来促进实验设计. 该协议需要 1.5 小时到 3.5 天才能完成，具体取决于所使用的细胞群（贴壁细胞可能需要几天才能在样品载体上生长）。我们的协议已在两条同步加速器光束线（英国 Diamond Light Source 的 B24 和西班牙 ALBA 的 BL09 Mistral）上进行了测试，并导致开发了一种决策辅助工具，该辅助工具可根据项目要求通过战略性使用标记来促进实验设计. 该协议需要 1.5 小时到 3.5 天才能完成，具体取决于所使用的细胞群（贴壁细胞可能需要几天才能在样品载体上生长）。我们的协议已在两条同步加速器光束线（英国 Diamond Light Source 的 B24 和西班牙 ALBA 的 BL09 Mistral）上进行了测试，并导致开发了一种决策辅助工具，该辅助工具可根据项目要求通过战略性使用标记来促进实验设计. 该协议需要 1.5 小时到 3.5 天才能完成，具体取决于所使用的细胞群（贴壁细胞可能需要几天才能在样品载体上生长）。