FoF1-ATP synthases are ubiquitous membrane-bound, rotary motor enzymes that can catalyze ATP synthesis and hydrolysis. Their enzyme kinetics are controlled by internal subunit rotation, by substrate and product concentrations, by mechanical inhibitory mechanisms, but also by the electrochemical potential of protons across the membrane. Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) has been used to detect subunit rotation within FoF1-ATP synthases embedded in freely diffusing liposomes. We now report that kinetic monitoring of functional rotation can be prolonged from milliseconds to seconds by utilizing an Anti-Brownian electrokinetic trap (ABEL trap). These extended observation times allowed us to observe fluctuating rates of functional rotation for individual FoF1-liposomes in solution. Broad distributions of ATP-dependent catalytic rates were revealed. The buildup of an electrochemical potential of protons was confirmed to limit the maximum rate of ATP hydrolysis. In the presence of ionophores or uncouplers, the fastest subunit rotation speeds measured in single reconstituted FoF1-ATP synthases were 180 full rounds per second. This was much faster than measured by biochemical ensemble averaging, but not as fast as the maximum rotational speed reported previously for isolated single F1 complexes uncoupled from the membrane-embedded Fo complex. Further application of ABEL trap measurements should help resolve the mechanistic causes of such fluctuating rates of subunit rotation.

中文翻译：

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捕获在溶液中的重组 FoF1-ATP 合酶中的快速 ATP 依赖性亚基旋转

FoF1-ATP 合酶是无处不在的膜结合旋转运动酶，可催化 ATP 合成和水解。它们的酶动力学受内部亚基旋转、底物和产物浓度、机械抑制机制以及质子跨膜电化学势的控制。单分子 Förster 共振能量转移 (smFRET) 已被用于检测嵌入自由扩散脂质体中的 FoF1-ATP 合酶内的亚基旋转。我们现在报告说，通过使用反布朗电动陷阱（ABEL 陷阱），功能旋转的动力学监测可以从几毫秒延长到几秒。这些延长的观察时间使我们能够观察溶液中单个 FoF1-脂质体的功能旋转的波动率。揭示了 ATP 依赖性催化速率的广泛分布。质子电化学势的积累被证实限制了 ATP 水解的最大速率。在存在离子载体或解偶联剂的情况下，在单个重构的 FoF1-ATP 合酶中测得的最快亚基旋转速度为每秒 180 整轮。这比通过生化整体平均测量的速度快得多，但不如之前报道的与膜嵌入的 Fo 复合物分离的孤立单个 F1 复合物的最大旋转速度快。ABEL 陷阱测量的进一步应用应该有助于解决亚基旋转速率这种波动的机械原因。在存在离子载体或解偶联剂的情况下，在单个重构的 FoF1-ATP 合酶中测得的最快亚基旋转速度为每秒 180 整轮。这比通过生化整体平均测量的速度快得多，但不如之前报道的与膜嵌入的 Fo 复合物分离的孤立单个 F1 复合物的最大旋转速度快。ABEL 陷阱测量的进一步应用应该有助于解决亚基旋转速率这种波动的机械原因。在存在离子载体或解偶联剂的情况下，在单个重构的 FoF1-ATP 合酶中测得的最快亚基旋转速度为每秒 180 整轮。这比通过生化整体平均测量的速度快得多，但不如之前报道的与膜嵌入的 Fo 复合物分离的孤立单个 F1 复合物的最大旋转速度快。ABEL 陷阱测量的进一步应用应该有助于解决亚基旋转速率这种波动的机械原因。但不如之前报道的与膜嵌入的 Fo 复合物分离的孤立单个 F1 复合物的最大旋转速度快。ABEL 陷阱测量的进一步应用应该有助于解决亚基旋转速率这种波动的机械原因。但不如之前报道的与膜嵌入的 Fo 复合物分离的孤立单个 F1 复合物的最大旋转速度快。ABEL 陷阱测量的进一步应用应该有助于解决这种亚基旋转速率波动的机械原因。