Chromatin conformation capture (3C) methods and fluorescent in situ hybridization (FISH) microscopy have been used to investigate the spatial organization of the genome. Although powerful, both techniques have limitations. Hi-C is challenging for low cell numbers and requires very deep sequencing to achieve its high resolution. In contrast, FISH can be done on small cell numbers and capture rare cell populations, but typically targets pairs of loci at a lower resolution. Here we detail a protocol for optical reconstruction of chromatin architecture (ORCA), a microscopy approach to trace the 3D DNA path within the nuclei of fixed tissues and cultured cells with a genomic resolution as fine as 2 kb and a throughput of ~10,000 cells per experiment. ORCA can identify structural features with comparable resolution to Hi-C while providing single-cell resolution and multimodal measurements characteristic of microscopy. We describe how to use this DNA labeling in parallel with multiplexed labeling of dozens of RNAs to relate chromatin structure and gene expression in the same cells. Oligopaint probe design, primary probe making, sample collection, cryosectioning and RNA/DNA primary probe hybridization can be completed in 1.5 weeks, while automated RNA/DNA barcode hybridization and RNA/DNA imaging typically takes 2–6 d for data collection and 2–7 d for the automated steps of image analysis.

染色质构象捕获 (3C) 方法和荧光原位杂交 (FISH) 显微镜已用于研究基因组的空间组织。尽管功能强大，但这两种技术都有局限性。Hi-C 对低细胞数具有挑战性，需要非常深度的测序才能实现其高分辨率。相比之下，FISH 可以在小细胞数量上进行并捕获稀有细胞群，但通常以较低的分辨率靶向基因座对。在这里，我们详细介绍了染色质结构光学重建协议 (ORCA)，这是一种显微镜方法，用于追踪固定组织和培养细胞的细胞核内的 3D DNA 路径，基因组分辨率高达 2 kb，吞吐量约为 10,000 个细胞/实验。ORCA 可以识别具有与 Hi-C 相当的分辨率的结构特征，同时提供显微镜的单细胞分辨率和多模式测量特征。我们描述了如何同时使用这种 DNA 标记和多种 RNA 的多重标记来关联同一细胞中的染色质结构和基因表达。Oligopaint 探针设计、初级探针制作、样本采集、冷冻切片和 RNA/DNA 初级探针杂交可在 1.5 周内完成，而自动化 RNA/DNA 条形码杂交和 RNA/DNA 成像通常需要 2-6 天的数据收集和 2-2 7 d 用于图像分析的自动化步骤。我们描述了如何同时使用这种 DNA 标记和多种 RNA 的多重标记来关联同一细胞中的染色质结构和基因表达。Oligopaint 探针设计、初级探针制作、样本采集、冷冻切片和 RNA/DNA 初级探针杂交可在 1.5 周内完成，而自动化 RNA/DNA 条形码杂交和 RNA/DNA 成像通常需要 2-6 天的数据收集和 2-2 7 d 用于图像分析的自动化步骤。我们描述了如何同时使用这种 DNA 标记和多种 RNA 的多重标记来关联同一细胞中的染色质结构和基因表达。Oligopaint 探针设计、初级探针制作、样本采集、冷冻切片和 RNA/DNA 初级探针杂交可在 1.5 周内完成，而自动化 RNA/DNA 条形码杂交和 RNA/DNA 成像通常需要 2-6 天的数据收集和 2-2 7 d 用于图像分析的自动化步骤。