In recent years, highly sensitive mass spectrometry–based phosphoproteomic analysis is beginning to be applied to identification of protein kinase substrates altered downstream of increased cAMP. Such studies identify a very large number of phosphorylation sites regulated in response to increased cAMP. Therefore, we now are tasked with the challenge of determining how many of these altered phosphorylation sites are relevant to regulation of function in the cell. This minireview describes the use of phosphoproteomic analysis to monitor the effects of cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) inhibitors on cAMP-dependent phosphorylation events. More specifically, it describes two examples of this approach carried out in the authors’ laboratories using the selective PDE inhibitor approach. After a short discussion of several likely conclusions suggested by these analyses of cAMP function in steroid hormone–producing cells and also in T-cells, it expands into a discussion about some newer and more speculative interpretations of the data. These include the idea that multiple phosphorylation sites and not a single rate-limiting step likely regulate these and, by analogy, many other cAMP-dependent pathways. In addition, the idea that meaningful regulation requires a high stoichiometry of phosphorylation to be important is discussed and suggested to be untrue in many instances. These new interpretations have important implications for drug design, especially for targeting pathway agonists.

中文翻译：

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磷酸蛋白质组学分析作为一种了解 cAMP 依赖性作用的分子机制的方法

近年来，基于高灵敏度质谱的磷酸蛋白质组学分析开始应用于识别在 cAMP 增加的下游发生改变的蛋白激酶底物。此类研究确定了大量响应于 cAMP 增加而受到调节的磷酸化位点。因此，我们现在的任务是确定这些改变的磷酸化位点中有多少与细胞功能的调节有关。本综述描述了使用磷酸蛋白质组学分析来监测环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 抑制剂对 cAMP 依赖性磷酸化事件的影响。更具体地说，它描述了在作者的实验室中使用选择性 PDE 抑制剂方法进行的这种方法的两个示例。在对这些对类固醇激素产生细胞和 T 细胞中 cAMP 功能的分析提出的几个可能结论进行简短讨论之后，它扩展到对数据的一些更新和更具推测性的解释的讨论。这些包括多个磷酸化位点而不是单个限速步骤可能调节这些以及类似地调节许多其他 cAMP 依赖性途径的想法。此外，讨论了有意义的调节需要高化学计量的磷酸化是重要的想法，并认为在许多情况下是不正确的。这些新的解释对药物设计具有重要意义，特别是对于靶向途径激动剂。它扩展到对数据的一些更新和更具推测性的解释的讨论。这些包括多个磷酸化位点而不是单个限速步骤可能调节这些以及类似地调节许多其他 cAMP 依赖性途径的想法。此外，讨论了有意义的调节需要高化学计量的磷酸化是重要的想法，并认为在许多情况下是不正确的。这些新的解释对药物设计具有重要意义，特别是对于靶向途径激动剂。它扩展到对数据的一些更新和更具推测性的解释的讨论。这些包括多个磷酸化位点而不是单个限速步骤可能调节这些以及类似地调节许多其他 cAMP 依赖性途径的想法。此外，讨论了有意义的调节需要高化学计量的磷酸化是重要的想法，并认为在许多情况下是不正确的。这些新的解释对药物设计具有重要意义，特别是对于靶向途径激动剂。讨论了有意义的监管需要高化学计量的磷酸化是重要的想法，并认为在许多情况下是不正确的。这些新的解释对药物设计具有重要意义，特别是对于靶向途径激动剂。讨论了有意义的监管需要高化学计量的磷酸化是重要的想法，并认为在许多情况下是不正确的。这些新的解释对药物设计具有重要意义，特别是对于靶向途径激动剂。