Dengue virus NS3 is a prototypical DEx(H/D) helicase that binds and hydrolyzes NTP to translocate along and unwind double-stranded nucleic acids. NS3 and NS4B are essential components of the flavivirus replication complex. Evidences showed that NS4B interacted with NS3 and modulated the helicase activity of NS3. Despite important insights into structural, mechanistic, and cellular aspects of the NS3 function, there is still a gap in understanding how it coordinates the helicase activities within the replicase complex for efficient replication. Here, using the DENV2 as a model, we redefined the critical region of NS4B required for NS3 function by pull-down and MST assays. The FRET-based unwinding assay showed that NS3 would accelerate unwinding duplex nucleic acids in the presence of NS4B (51-83). The simulated NS3-NS4B complex models based on the rigid-body docking delineated the potential interaction sites located in the conserved motif within the core domain of NS3. Mutations in motif I (I190A) and motif III (P319L) of NS3 interfered with the unwinding activity stimulated by NS4B. Upon binding to the NS3 helicase, NS4B assisted NS3 to dissociate from single-stranded nucleic acid and enabled NS3 helicase to keep high activity at high ATP concentrations. These results suggest that NS4B probably serves as an essential cofactor for NS3 to coordinate the ATP cycles and nucleic acid binding during viral genome replication.

登革热病毒 NS3 是一种原型 DEx(H/D) 解旋酶，它结合并水解 NTP 以沿双链核酸易位和解旋。NS3 和 NS4B 是黄病毒复制复合物的重要组成部分。有证据表明，NS4B 与 NS3 相互作用并调节 NS3 的解旋酶活性。尽管对 NS3 功能的结构、机制和细胞方面有重要见解，但在理解它如何协调复制酶复合物中的解旋酶活性以实现有效复制方面仍然存在差距。在这里，我们使用 DENV2 作为模型，通过下拉和 MST 分析重新定义了 NS3 功能所需的 NS4B 关键区域。基于 FRET 的展开分析表明，在 NS4B 存在的情况下，NS3 会加速双链核酸的展开 (51-83)。基于刚体对接的模拟 NS3-NS4B 复杂模型描绘了位于 NS3 核心域内的保守基序中的潜在相互作用位点。NS3 的基序 I (I190A) 和基序 III (P319L) 的突变干扰了 NS4B 刺激的展开活动。在与 NS3 解旋酶结合后，NS4B 协助 NS3 从单链核酸中解离，并使 NS3 解旋酶在高 ATP 浓度下保持高活性。这些结果表明，NS4B 可能是 NS3 在病毒基因组复制过程中协调 ATP 循环和核酸结合的必要辅助因子。NS3 的基序 I (I190A) 和基序 III (P319L) 的突变干扰了 NS4B 刺激的展开活动。在与 NS3 解旋酶结合后，NS4B 帮助 NS3 从单链核酸中解离，并使 NS3 解旋酶在高 ATP 浓度下保持高活性。这些结果表明，NS4B 可能是 NS3 在病毒基因组复制过程中协调 ATP 循环和核酸结合的必要辅助因子。NS3 的基序 I (I190A) 和基序 III (P319L) 的突变干扰了 NS4B 刺激的展开活动。在与 NS3 解旋酶结合后，NS4B 协助 NS3 从单链核酸中解离，并使 NS3 解旋酶在高 ATP 浓度下保持高活性。这些结果表明，NS4B 可能作为 NS3 的重要辅助因子，在病毒基因组复制过程中协调 ATP 循环和核酸结合。