Human noroviruses are a major cause for gastroenteritis outbreaks. Filter-feeding bivalve molluscs, which accumulate noroviruses in their digestive tissues, are a typical vector for human infection. RT-qPCR, the established method for human norovirus detection in food, does not allow discrimination between infectious and non-infectious viruses and can overestimate potentially infectious viral loads. To develop a more accurate method of infectious norovirus load estimation, we combined intercalating agent propidium monoazide (PMAxx™)-pre-treatment with RT-qPCR assay using in vitro-cultivable murine norovirus. Three primer sets targeting different genome regions and diverse amplicon sizes were used to compare one-step amplification of a short genome fragment to three two-step long-range RT-qPCRs (7 kbp, 3.6 kbp and 2.3 kbp amplicons). Following initial assays performed on untreated infectious, heat-, or ultraviolet-inactivated murine noroviruses in PBS suspension, PMAxx™ RT-qPCRs were implemented to detect murine noroviruses subsequent to their extraction from mussel digestive tissues; virus extraction via anionic polymer-coated magnetic beads was compared with the proteinase K-dependent ISO norm. The long-range RT-qPCR process detecting fragments of more than 2.3 kbp allowed accurate estimation of the infectivity of UV-damaged murine noroviruses. While proteinase K extraction limited later estimation of PMAxx™ pre-treatment effects and was found to be unsuited to the assay, magnetic bead-captured murine noroviruses retained their infectivity. Genome copies of heat-inactivated murine noroviruses differed by 2.3 log₁₀ between RT-qPCR and PMAxx™-RT-qPCR analysis in bivalve molluscs, the PMAxx™ pre-treatment allowing a closer approximation of infectious titres. The combination of bead-based virus extraction and PMAxx™ RT-qPCR thus provides a more accurate model for the estimation of noroviral bivalve mollusc contamination than the conjunction of proteinase K extraction and RT-qPCR and has the potential (once validated utilising infectious human norovirus) to provide an added measure of security to food safety authorities in the hazard assessment of potential bivalve mollusc contamination.

人类诺如病毒是肠胃炎爆发的主要原因。滤食性双壳类软体动物在其消化组织中积累诺如病毒，是人类感染的典型载体。RT-qPCR 是食品中人类诺如病毒检测的既定方法，不允许区分传染性和非传染性病毒，并且可能高估潜在传染性病毒载量。为了开发一种更准确的传染性诺如病毒载量估计方法，我们将嵌入剂单叠氮丙啶 (PMAxx™) 预处理与使用体外可培养鼠诺如病毒的 RT-qPCR 检测相结合。针对不同基因组区域和不同扩增子大小的三个引物组用于比较短基因组片段的一步扩增与三个两步长程 RT-qPCR（7 kbp、3.6 kbp 和 2.3 kbp 扩增子）。在对 PBS 悬浮液中未经处理的传染性、热灭活或紫外线灭活的鼠科诺如病毒进行初步分析后，实施 PMAxx™ RT-qPCR 以检测从贻贝消化组织中提取的鼠科诺如病毒；通过阴离子聚合物包被的磁珠提取病毒与蛋白酶 K 依赖的 ISO 标准进行了比较。远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log 或 PBS 悬浮液中紫外线灭活的鼠诺如病毒，实施 PMAxx™ RT-qPCR 以检测从贻贝消化组织中提取的鼠诺如病毒；通过阴离子聚合物包被的磁珠提取病毒与蛋白酶 K 依赖的 ISO 标准进行了比较。远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log 或 PBS 悬浮液中紫外线灭活的鼠诺如病毒，实施 PMAxx™ RT-qPCR 以检测从贻贝消化组织中提取的鼠诺如病毒；通过阴离子聚合物包被的磁珠提取病毒与蛋白酶 K 依赖的 ISO 标准进行了比较。远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log PMAxx™ RT-qPCR 用于检测从贻贝消化组织中提取的鼠诺如病毒；通过阴离子聚合物包被的磁珠提取病毒与蛋白酶 K 依赖的 ISO 标准进行了比较。远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log PMAxx™ RT-qPCR 用于检测从贻贝消化组织中提取的鼠诺如病毒；通过阴离子聚合物包被的磁珠提取病毒与蛋白酶 K 依赖的 ISO 标准进行了比较。远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log 远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log 远距离 RT-qPCR 过程检测超过 2.3 kbp 的片段可以准确估计紫外线损伤的鼠科诺如病毒的感染性。虽然蛋白酶 K 提取限制了后来对 PMAxx™ 预处理效果的估计，并且被发现不适合该测定，但磁珠捕获的鼠诺如病毒保留了它们的传染性。热灭活的鼠诺如病毒的基因组拷贝相差 2.3 log₁₀在双壳类软体动物的 RT-qPCR 和 PMAxx™-RT-qPCR 分析之间，PMAxx™ 预处理允许更接近感染滴度的近似值。因此，与蛋白酶 K 提取和 RT-qPCR 的结合相比，基于珠子的病毒提取和 PMAxx™ RT-qPCR 的组合为估计诺如病毒双壳类软体动物污染提供了更准确的模型，并且具有潜力（一旦利用传染性人类诺如病毒进行验证） ) 为食品安全当局在潜在双壳类软体动物污染的危害评估中提供额外的安全措施。