Synthetic biology efforts often require high-throughput screening tools for enzyme engineering campaigns. While innovations in chromatographic and mass spectrometry-based techniques provide relevant structural information associated with enzyme activity, these approaches can require cost-intensive instrumentation and technical expertise not broadly available. Moreover, complex workflows and analysis time can significantly impact throughput. To this end, we develop an automated, 96-well screening platform based on thin layer chromatography (TLC) and use it to monitor in vitro activity of a geranylgeranyl reductase isolated from Sulfolobus acidocaldarius (SaGGR). Unreduced SaGGR products are oxidized to their corresponding epoxide and applied to thin layer silica plates by acoustic printing. These derivatives are chromatographically separated based on the extent of epoxidation and are covalently ligated to a chromophore, allowing detection of enzyme variants with unique product distributions or enhanced reductase activity. Herein, we employ this workflow to examine farnesol reduction using a codon-saturation mutagenesis library at the Leu377 site of SaGGR. We show this TLC-based screen can distinguish between fourfold differences in enzyme activity for select mutants and validated those results by GC–MS. With appropriate quantitation methods, this workflow can be used to screen polyprenyl reductase activity and can be readily adapted to analyze broader catalyst libraries whose products are amenable to TLC analysis.

中文翻译：

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使用高通量薄层色谱法筛选烯烃还原酶的自动化工作流程

合成生物学的努力通常需要高通量的筛选工具来进行酶工程研究。尽管基于色谱和质谱的技术创新提供了与酶活性相关的相关结构信息，但这些方法可能需要昂贵的仪器和广泛使用的技术专长。此外，复杂的工作流程和分析时间会严重影响吞吐量。为此，我们开发了一个基于薄层色谱（TLC）的自动化96孔筛选平台，并使用它来监测从Sulfolobus acidocaldarius（SaGGR）分离的Geranylgeranyl还原酶的体外活性。未还原的SaGGR产​​物被氧化成其相应的环氧化物，并通过声学印刷法施加到薄层二氧化硅板上。这些衍生物根据环氧化程度进行色谱分离，并与发色团共价连接，从而可以检测具有独特产物分布或增强的还原酶活性的酶变体。在本文中，我们使用此工作流程使用SaGGR的Leu377站点的密码子饱和诱变文库检查法呢醇的还原反应。我们显示出这种基于TLC的筛选可以区分所选突变体的酶活性的四倍差异，并通过GC-MS验证了这些结果。通过适当的定量方法，该工作流程可用于筛选聚异戊二烯还原酶活性，并可轻松地用于分析其产物适合TLC分析的更广泛的催化剂库。可以检测具有独特产物分布或增强的还原酶活性的酶变体。在本文中，我们使用此工作流程使用SaGGR的Leu377站点的密码子饱和诱变文库检查法呢醇的还原反应。我们显示出这种基于TLC的筛选可以区分所选突变体的酶活性的四倍差异，并通过GC-MS验证了这些结果。通过适当的定量方法，该工作流程可用于筛选聚异戊二烯还原酶活性，并可轻松地用于分析其产物适合TLC分析的更广泛的催化剂库。可以检测具有独特产物分布或增强的还原酶活性的酶变体。在本文中，我们使用此工作流程使用SaGGR的Leu377站点的密码子饱和诱变文库检查法呢醇的还原反应。我们显示出这种基于TLC的筛选可以区分所选突变体的酶活性的四倍差异，并通过GC-MS验证了这些结果。通过适当的定量方法，该工作流程可用于筛选聚异戊二烯还原酶活性，并可轻松地用于分析其产物适合TLC分析的更广泛的催化剂库。我们显示出这种基于TLC的筛选可以区分所选突变体的酶活性的四倍差异，并通过GC-MS验证了这些结果。通过适当的定量方法，该工作流程可用于筛选聚异戊二烯还原酶活性，并可轻松地用于分析其产物适合TLC分析的更广泛的催化剂库。我们显示出这种基于TLC的筛选可以区分所选突变体的酶活性的四倍差异，并通过GC-MS验证了这些结果。通过适当的定量方法，该工作流程可用于筛选聚异戊二烯还原酶活性，并可轻松地用于分析其产物适合TLC分析的更广泛的催化剂库。