Bacteria overexpress, under condition of starvation or oxidative stress, Dps (DNA-binding proteins from starved cells), hollow sphere formed by 12 identical subunits endowed with ferritin-like activity. The iron oxidation and incorporation in Dps take place using H2O2 produced under starvation as preferred iron oxidant, thereby protecting bacteria from oxidative damage. Even if the role of Dps is well known, the mechanism of iron oxidation and incorporation remain to be elucidated. Here, we have used the EPR technique to shed light on the Fe(II) binding and oxidation mechanism at the ferroxidase center using both the wild-type (wt) protein and mutants of the iron ligands (H31G, H43G and H31G-H43G-D58A). The EPR titration of wt Dps and the H31G mutant with Fe(II) upon H2O2 addition shows that Fe(II) is oxidized with the increase of the signal at g = 4.3, reaching a maximum for 12 Fe(II)/subunit. The EPR signal becomes negligible when the titration is carried out on the triple mutant. These experiments indicate that the iron firstly occupied the A site at the ferroxidase center and confirm that the residues H31, H43 and D58 have a key role in the iron oxidation and incorporation process. Moreover, the data indicate that the ferroxidase center, upon mutation of H31 or H43 to Gly, changes the mode of iron binding. Finally, we demonstrate here that, when the iron micelle forms, the EPR signal at g = 4.3 disappears indicating that iron leaves the ferroxidase center to reach the inner cavity.

中文翻译：

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通过 EPR 光谱法揭示无害李斯特菌 Dps 中铁掺入的分子机制

在饥饿或氧化应激条件下，细菌过度表达 Dps（来自饥饿细胞的 DNA 结合蛋白），由 12 个具有铁蛋白样活性的相同亚基形成的空心球体。使用饥饿条件下产生的 H2O2 作为优选的铁氧化剂，在 Dps 中进行铁氧化和掺入，从而保护细菌免受氧化损伤。即使 Dps 的作用众所周知，但铁氧化和掺入的机制仍有待阐明。在这里，我们使用 EPR 技术，使用野生型 (wt) 蛋白和铁配体的突变体 (H31G、H43G 和 H31G-H43G-) 阐明了亚铁氧化物酶中心的 Fe(II) 结合和氧化机制。 D58A)。加入 H2O2 后，wt Dps 和含有 Fe(II) 的 H31G 突变体的 EPR 滴定表明 Fe(II) 随着信号在 g = 4.3 处的增加而被氧化，达到 12 Fe(II)/亚基的最大值。当对三重突变体进行滴定时，EPR 信号变得可以忽略不计。这些实验表明铁首先占据亚铁氧化酶中心的 A 位点，并证实残基 H31、H43 和 D58 在铁氧化和掺入过程中起关键作用。此外，数据表明亚铁氧化物酶中心在 H31 或 H43 突变为 Gly 后，会改变铁结合模式。最后，我们在这里证明，当铁胶束形成时，g = 4.3 处的 EPR 信号消失，表明铁离开亚铁氧化酶中心到达内腔。当对三重突变体进行滴定时，EPR 信号变得可以忽略不计。这些实验表明铁首先占据亚铁氧化酶中心的 A 位点，并证实残基 H31、H43 和 D58 在铁氧化和掺入过程中起关键作用。此外，数据表明亚铁氧化物酶中心在 H31 或 H43 突变为 Gly 后，会改变铁结合模式。最后，我们在这里证明，当铁胶束形成时，g = 4.3 处的 EPR 信号消失，表明铁离开亚铁氧化酶中心到达内腔。当对三重突变体进行滴定时，EPR 信号变得可以忽略不计。这些实验表明铁首先占据亚铁氧化酶中心的 A 位点，并证实残基 H31、H43 和 D58 在铁氧化和掺入过程中起关键作用。此外，数据表明亚铁氧化物酶中心在 H31 或 H43 突变为 Gly 后，会改变铁结合模式。最后，我们在这里证明，当铁胶束形成时，g = 4.3 处的 EPR 信号消失，表明铁离开亚铁氧化酶中心到达内腔。H43 和 D58 在铁氧化和掺入过程中起关键作用。此外，数据表明亚铁氧化物酶中心在 H31 或 H43 突变为 Gly 后，会改变铁结合模式。最后，我们在这里证明，当铁胶束形成时，g = 4.3 处的 EPR 信号消失，表明铁离开亚铁氧化酶中心到达内腔。H43 和 D58 在铁氧化和掺入过程中起关键作用。此外，数据表明亚铁氧化物酶中心在 H31 或 H43 突变为 Gly 后，会改变铁结合模式。最后，我们在这里证明，当铁胶束形成时，g = 4.3 处的 EPR 信号消失，表明铁离开亚铁氧化酶中心到达内腔。