Post-translational modifications to tubulin are important for many microtubule-based functions inside cells. A recently identified tubulin modification, methylation, occurs on mitotic spindle microtubules during cell division, and is enzymatically added to tubulin by the histone methyltransferase SETD2. We used a truncated version of human SETD2 (tSETD2) containing the catalytic SET and C-terminal Set2 Rpb1 interacting (SRI) domains to investigate the biochemical mechanism of tubulin methylation. We found that recombinant tSETD2 has a higher activity towards tubulin dimers than polymerized microtubules. Using recombinant single-isotype tubulin, we demonstrate that methylation is restricted to lysine 40 (K40) of α-tubulin. We then introduced pathogenic mutations into tSETD2 to probe the recognition of histone and tubulin substrates. A mutation in the catalytic domain, R1625C, bound to tubulin but could not methylate it whereas a mutation in the SRI domain, R2510H, caused loss of both tubulin binding and methylation. We thus further probed a role for the SRI domain in substrate binding and found that mutations within this region had differential effects on the ability of tSETD2 to bind to tubulin versus RNA Polymerase II substrates, suggesting distinct mechanisms for tubulin and histone methylation by SETD2. Lastly, we found that substrate recognition also requires the negatively-charged C-terminal tail of α-tubulin. Together, this work provides a framework for understanding how SETD2 serves as a dual methyltransferase for histone and tubulin methylation.

中文翻译：

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SETD2决定α-微管蛋白甲基化的分子决定因素

微管蛋白的翻译后修饰对于细胞内部许多基于微管的功能很重要。最近鉴定出的微管蛋白修饰（甲基化）发生在细胞分裂过程中的有丝分裂纺锤体微管上，并通过组蛋白甲基转移酶SETD2酶促地添加到微管蛋白中。我们使用包含催化SET和C端Set2 Rpb1相互作用（SRI）域的人类SETD2（tSETD2）的截短版本来研究微管蛋白甲基化的生化机制。我们发现重组tSETD2对微管蛋白二聚体的活性高于聚合微管。使用重组单一同型微管蛋白，我们证明甲基化仅限于α-微管蛋白的赖氨酸40（K40）。然后，我们将病原性突变引入tSETD2中，以探测对组蛋白和微管蛋白底物的识别。催化域R1625C的突变与微管蛋白结合，但不能甲基化，而SRI结构域R2510H的突变导致微管蛋白结合和甲基化丧失。因此，我们进一步探究了SRI结构域在底物结合中的作用，发现该区域内的突变对tSETD2结合微管蛋白的能力与RNA聚合酶II底物的结合能力产生了不同的影响，这表明SETD2对微管蛋白和组蛋白甲基化的机制不同。最后，我们发现底物识别还需要α-微管蛋白的负电​​荷C末端尾巴。总之，这项工作为理解SETD2如何作为组蛋白和微管蛋白甲基化的双重甲基转移酶提供了框架。引起微管蛋白结合和甲基化的丧失。因此，我们进一步探究了SRI结构域在底物结合中的作用，发现该区域内的突变对tSETD2结合微管蛋白的能力与RNA聚合酶II底物的结合能力产生了不同的影响，这表明SETD2对微管蛋白和组蛋白甲基化的机制不同。最后，我们发现底物识别还需要α-微管蛋白的负电​​荷C末端尾巴。总之，这项工作为理解SETD2如何作为组蛋白和微管蛋白甲基化的双重甲基转移酶提供了框架。引起微管蛋白结合和甲基化的丧失。因此，我们进一步探究了SRI结构域在底物结合中的作用，发现该区域内的突变对tSETD2结合微管蛋白的能力与RNA聚合酶II底物的结合能力产生了不同的影响，这表明SETD2对微管蛋白和组蛋白甲基化的机制不同。最后，我们发现底物识别还需要α-微管蛋白的负电​​荷C末端尾巴。总之，这项工作为理解SETD2如何作为组蛋白和微管蛋白甲基化的双重甲基转移酶提供了框架。因此，我们进一步探究了SRI结构域在底物结合中的作用，发现该区域内的突变对tSETD2结合微管蛋白的能力与RNA聚合酶II底物的结合能力产生了不同的影响，这表明SETD2对微管蛋白和组蛋白甲基化的机制不同。最后，我们发现底物识别还需要α-微管蛋白的负电​​荷C末端尾巴。总之，这项工作为理解SETD2如何作为组蛋白和微管蛋白甲基化的双重甲基转移酶提供了框架。因此，我们进一步探究了SRI结构域在底物结合中的作用，发现该区域内的突变对tSETD2结合微管蛋白的能力与RNA聚合酶II底物的结合能力产生了不同的影响，这表明SETD2对微管蛋白和组蛋白甲基化的机制不同。最后，我们发现底物识别还需要α-微管蛋白的负电​​荷C末端尾巴。总之，这项工作为理解SETD2如何作为组蛋白和微管蛋白甲基化的双重甲基转移酶提供了框架。