Posttranslational protein targeting requires chaperone assistance to direct insertion-competent proteins to integration pathways. Chloroplasts integrate nearly all thylakoid transmembrane proteins posttranslationally, but mechanisms in the stroma that assist their insertion remain largely undefined. Here, we investigated how the chloroplast chaperonin (Cpn60) facilitated the thylakoid integration of Plastidic type I signal peptidase 1 (Plsp1) using in vitro targeting assays. Cpn60 bound Plsp1 in the stroma. In isolated chloroplasts, the membrane integration of imported Plsp1 correlated with its dissociation from Cpn60. When the Plsp1 residues that interacted with Cpn60 were removed, Plsp1 did not integrate into the membrane. These results suggested Cpn60 was an intermediate in thylakoid targeting of Plsp1. In isolated thylakoids, the integration of Plsp1 decreased when Cpn60 was present in excess of cpSecA1, the stromal motor of the cpSec1 translocon that inserts unfolded Plsp1 into the thylakoid. An excess of cpSecA1 favored integration. Introducing Cpn60’s obligate substrate RbcL displaced Cpn60-bound Plsp1; then, the released Plsp1 exhibited increased accessibility to cpSec1. These in vitro targeting experiments support a model in which Cpn60 captures and then releases insertion-competent Plsp1, whereas cpSecA1 recognizes free Plsp1 for integration. Thylakoid transmembrane proteins in the stroma can interact with Cpn60 to shield themselves from the aqueous environment.

翻译后蛋白质靶向需要分子伴侣协助以将具有插入能力的蛋白质引导至整合途径。叶绿体在翻译后整合了几乎所有的类囊体跨膜蛋白，但基质中帮助它们插入的机制在很大程度上仍未确定。在这里，我们使用体外靶向测定研究了叶绿体伴侣蛋白 (Cpn60) 如何促进质体 I 型信号肽酶 1 (Plsp1) 的类囊体整合。Cpn60 在基质中结合 Plsp1。在分离的叶绿体中，导入的 Plsp1 的膜整合与其从 Cpn60 的解离相关。当与 Cpn60 相互作用的 Plsp1 残基被去除时，Plsp1 没有整合到膜中。这些结果表明 Cpn60 是类囊体靶向 Plsp1 的中间体。在孤立的类囊体中，当 Cpn60 存在超过 cpSecA1 时，Plsp1 的整合减少，cpSec1 转位子的基质马达将展开的 Plsp1 插入类囊体。过量的 cpSecA1 有利于整合。引入 Cpn60 的专性底物 RbcL 取代了 Cpn60 结合的 Plsp1；然后，发布的 Plsp1 表现出对 cpSec1 的增加的可访问性。这些体外靶向实验支持一个模型，其中 Cpn60 捕获然后释放具有插入能力的 Plsp1，而 cpSecA1 识别免费的 Plsp1 进行整合。基质中的类囊体跨膜蛋白可以与 Cpn60 相互作用以保护自己免受水环境的影响。引入 Cpn60 的专性底物 RbcL 取代了 Cpn60 结合的 Plsp1；然后，发布的 Plsp1 表现出对 cpSec1 的增加的可访问性。这些体外靶向实验支持一个模型，其中 Cpn60 捕获然后释放具有插入能力的 Plsp1，而 cpSecA1 识别免费的 Plsp1 进行整合。基质中的类囊体跨膜蛋白可以与 Cpn60 相互作用以保护自己免受水环境的影响。引入 Cpn60 的专性底物 RbcL 取代了 Cpn60 结合的 Plsp1；然后，发布的 Plsp1 表现出对 cpSec1 的增加的可访问性。这些体外靶向实验支持一个模型，其中 Cpn60 捕获然后释放具有插入能力的 Plsp1，而 cpSecA1 识别免费的 Plsp1 进行整合。基质中的类囊体跨膜蛋白可以与 Cpn60 相互作用以保护自己免受水环境的影响。