Oat (Avena sativa L.), a hexaploid crop with unknown genome, has valuable nutritional, medicinal and pharmaceutical uses. However, no suitable RGs (reference genes) for qPCR (quantitative real-time PCR) has been documented for oat yet. Single-copy gene is often selected as RG, which is challengeable or impactable in unexplored polyploids. In this study, eleven candidate RGs, including four duplicated genes, were selected from oat transcriptome. The stability and the optimal combination of these candidate RGs were assessed in 18 oat samples by using four statistical algorithms including the ΔCt method, geNorm, NormFinder and BestKeeper. The most stable RGs for “all samples”, “shoots and roots of seedlings”, “developing seeds” and “developing endosperms” were EIF4A (Eukaryotic initiation factor 4A-3), UBC21 (Ubiquitin-Conjugating Enzyme 21), EP (Expressed protein) and EIF4A respectively. Among these RGs, UBC21 was a four-copy duplicated gene. The reliability was validated by the expression patterns of four various genes normalized to the most and the least stable RGs in different sample sets. Results provide a proof of concept that the duplicated RG is feasible for qPCR in polyploids. To our knowledge, this study is the first systematic research on the optimal RGs for accurate qPCR normalization of gene expression in different organs and tissues of oat.

中文翻译：

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评估基因组未知六倍体燕麦（Avena sativa L.）中用于定量实时PCR分析的重复参考基因

燕麦（Avena sativa L.）是一种基因组未知的六倍体作物，具有宝贵的营养、药用和制药用途。然而，尚未记录燕麦的 qPCR（定量实时 PCR）合适的 RG（参考基因）。单拷贝基因通常被选为 RG，在未开发的多倍体中具有挑战性或影响力。在这项研究中，从燕麦转录组中选择了 11 个候选 RG，包括 4 个重复基因。通过使用包括 ΔCt 方法、geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 在内的四种统计算法，在 18 个燕麦样品中评估了这些候选 RGs 的稳定性和最佳组合。“所有样品”、“幼苗的枝条和根”、“发育中的种子”和“发育中的胚乳”最稳定的 RG 是 EIF4A（真核起始因子 4A-3）、UBC21（泛素结合酶 21）、EP（表达蛋白）和 EIF4A 分别。在这些RGs中，UBC21是一个四拷贝重复基因。通过标准化为不同样本集中最稳定和最不稳定的 RG 的四种不同基因的表达模式验证了可靠性。结果提供了一个概念证明，即重复的 RG 对于多倍体中的 qPCR 是可行的。据我们所知，这项研究是对最佳 RGs 的首次系统研究，用于准确 qPCR 标准化燕麦不同器官和组织中的基因表达。结果提供了一个概念证明，即重复的 RG 对于多倍体中的 qPCR 是可行的。据我们所知，这项研究是对最佳 RGs 的首次系统研究，用于准确 qPCR 标准化燕麦不同器官和组织中的基因表达。结果提供了一个概念证明，即重复的 RG 对于多倍体中的 qPCR 是可行的。据我们所知，这项研究是对最佳 RGs 的首次系统研究，用于准确 qPCR 标准化燕麦不同器官和组织中的基因表达。