The catalytic mechanism of H2 conversion by [NiFe]-hydrogenase is subject of extensive research. Apart from at least four reaction intermediates of H2/H+ cycling, there is also a number of resting states, which are formed under oxidizing conditions. While not directly involved in the catalytic cycle, knowledge of their molecular structure and reactivity is important, because these states usually accumulate in the course of hydrogenase purification, and they may also play a role in vivo during hydrogenase maturation. Here, we applied low-temperature infrared (cryo-IR) and nuclear resonance vibrational spectroscopy (NRVS) to the isolated catalytic subunit, HoxC, of the heterodimeric regulatory [NiFe]-hydrogenase (RH) from Ralstonia eutropha. Cryo-IR spectroscopy revealed that the HoxC protein can be enriched in almost pure redox states suitable for NRVS investigation. NRVS analysis of the hydrogenase catalytic center is usually hampered by strong spectral contributions of the FeS clusters of the small, electron-transferring subunit. Therefore, our approach to investigate the FeS cluster-free, 57Fe labeled HoxC granted an unprecedented view onto the active site modes, including those obscured by FeS cluster-derived bands. Rationalized by density functional theory (DFT) calculations, our data allow the structural description of two hydroxy-containing resting states. Our work highlights the relevance of cryogenic vibrational spectroscopy and DFT to elucidate the structure of barely defined redox states of the [NiFe]-hydrogenase active site.

中文翻译：

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低温振动光谱法和DFT计算揭示了[NiFe]-加氢酶的羟基桥接活性位点状态

[NiFe]-加氢酶催化H2转化的催化机理是广泛研究的课题。除了H2 / H +循环的至少四个反应中间体外，还存在许多在氧化条件下形成的静止状态。尽管不直接参与催化循环，但了解它们的分子结构和反应性很重要，因为这些状态通常会在氢化酶纯化过程中积累，并且在氢化酶成熟过程中也可能在体内发挥作用。在这里，我们将低温红外（cryo-IR）和核共振振动光谱（NRVS）应用于分离自Ralstonia eutropha的异二聚体调节[NiFe]-氢化酶（RH）的催化亚基HoxC。低温红外光谱显示，HoxC蛋白可以富集到几乎纯净的氧化还原状态，适合进行NRVS研究。氢化酶催化中心的NRVS分析通常受到小的电子转移亚基FeS簇的强光谱贡献的阻碍。因此，我们研究无FeS簇的，标记为57Fe的HoxC的方法，使人们对活性位点模式有了前所未有的了解，包括那些被FeS簇衍生的波段所遮盖的模式。通过密度泛函理论（DFT）计算合理化，我们的数据允许对两个含羟基的静态进行结构描述。我们的工作强调了低温振动光谱学和DFT的重要性，以阐明[NiFe]-加氢酶活性位点几乎未定义的氧化还原态的结构。氢化酶催化中心的NRVS分析通常受到小的电子转移亚基FeS簇的强光谱贡献的阻碍。因此，我们研究无FeS簇的，标记为57Fe的HoxC的方法，使人们对活性位点模式有了前所未有的了解，包括那些被FeS簇衍生的波段所遮盖的模式。通过密度泛函理论（DFT）计算合理化，我们的数据允许对两个含羟基的静态进行结构描述。我们的工作强调了低温振动光谱学和DFT的重要性，以阐明[NiFe]-加氢酶活性位点几乎未定义的氧化还原态的结构。氢化酶催化中心的NRVS分析通常受到小的电子转移亚基FeS簇的强光谱贡献的阻碍。因此，我们研究无FeS簇的，标记为57Fe的HoxC的方法，使人们对活性位点模式有了前所未有的了解，包括那些被FeS簇衍生的波段所遮盖的模式。通过密度泛函理论（DFT）计算合理化，我们的数据允许对两个含羟基的静态进行结构描述。我们的工作强调了低温振动光谱学和DFT的重要性，以阐明[NiFe]-加氢酶活性位点几乎未定义的氧化还原态的结构。我们研究无FeS簇，57Fe标记的HoxC的方法，使人们对活性位点模式有了前所未有的了解，包括那些由FeS簇衍生的波段所遮盖的位点。通过密度泛函理论（DFT）计算合理化，我们的数据允许对两个含羟基的静态进行结构描述。我们的工作强调了低温振动光谱学和DFT的重要性，以阐明[NiFe]-加氢酶活性位点几乎未定义的氧化还原态的结构。我们研究无FeS簇，57Fe标记的HoxC的方法，使人们对活性位点模式有了前所未有的了解，包括那些由FeS簇衍生的波段所遮盖的位点。通过密度泛函理论（DFT）计算合理化，我们的数据允许对两个含羟基的静态进行结构描述。我们的工作强调了低温振动光谱学和DFT的重要性，以阐明[NiFe]-加氢酶活性位点几乎未定义的氧化还原态的结构。