Cryopreservation of spermatogonial stem cells (SSCs) is important to preserve the lineages of valuable livestock and produce transgenic animals. Although interest in molecular-based cryopreservation methods have been increasing to improve their efficiency, the issue of necroptosis has not yet been considered. Therefore, the purpose of this study was to understand the role of necroptosis using necrostatin-1 (Nec-1), necroptosis inhibitor, in SSC cryopreservation, and to investigate the potential application of Nec-1 as a cryoprotectant. To determine the cryopreservation efficiency of Nec-1, we assessed recovery rate, proliferation potential, cellular membrane damage, RIP1 protein expression, apoptosis, and its mechanism. Stable characterization and functional activity of SSCs was determined via immunofluorescence, RT-qPCR, and in vivo transplantation of SSCs. Our results showed a higher proliferation potential in 50 μM Nec-1 (146.5 ± 16.8%) than in DMSO controls (100.0 ± 3.4%). Furthermore, the cryoprotective effects of Nec-1 were verified by a decrease in RIP1 expression (3.1 ± 0.2-fold vs. 1.3 ± 0.3-fold) and in early apoptosis (4.3 ± 0.8% vs. 2.6 ± 0.1%) compared to DMSO controls. Normal functional activity was observed in the SSCs after cryopreservation with 50 μM Nec-1. In conclusion, necroptosis could be a cause of cryoinjury, and their inhibitor may serve as potential effective cryoprotectant. This study will contribute to establish a molecular-based cryopreservation method, and thereby expanding the use of SSCs into the domestic livestock industry as well as for clinical applications.

中文翻译：

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Necrostatin-1 通过抑制坏死性凋亡和细胞凋亡提高小鼠精原干细胞的冷冻保存效率

精原干细胞 (SSC) 的冷冻保存对于保存有价值的牲畜的谱系和生产转基因动物非常重要。尽管人们对基于分子的冷冻保存方法的兴趣不断增加以提高其效率，但尚未考虑坏死性凋亡问题。因此，本研究的目的是了解使用 necroptosis 抑制剂 necrostatin-1 (Nec-1) 在 SSC 冷冻保存中的坏死性凋亡的作用，并研究 Nec-1 作为冷冻保护剂的潜在应用。为了确定 Nec-1 的冷冻保存效率，我们评估了恢复率、增殖潜力、细胞膜损伤、RIP1 蛋白表达、细胞凋亡及其机制。通过免疫荧光、RT-qPCR、和 SSC 的体内移植。我们的结果显示 50 μM Nec-1 (146.5 ± 16.8%) 比 DMSO 对照 (100.0 ± 3.4%) 具有更高的增殖潜力。此外，与 DMSO 相比，RIP1 表达（3.1 ± 0.2 倍与 1.3 ± 0.3 倍）和早期细胞凋亡（4.3 ± 0.8% 与 2.6 ± 0.1%）的降低证实了 Nec-1 的冷冻保护作用控件。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。我们的结果显示 50 μM Nec-1 (146.5 ± 16.8%) 比 DMSO 对照 (100.0 ± 3.4%) 具有更高的增殖潜力。此外，与 DMSO 相比，RIP1 表达（3.1 ± 0.2 倍与 1.3 ± 0.3 倍）和早期细胞凋亡（4.3 ± 0.8% 与 2.6 ± 0.1%）的降低证实了 Nec-1 的冷冻保护作用控件。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。我们的结果显示 50 μM Nec-1 (146.5 ± 16.8%) 比 DMSO 对照 (100.0 ± 3.4%) 具有更高的增殖潜力。此外，与 DMSO 相比，RIP1 表达（3.1 ± 0.2 倍与 1.3 ± 0.3 倍）和早期细胞凋亡（4.3 ± 0.8% 与 2.6 ± 0.1%）的降低证实了 Nec-1 的冷冻保护作用控件。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。与 DMSO 对照相比，Nec-1 的冷冻保护作用通过 RIP1 表达的降低（3.1 ± 0.2 倍与 1.3 ± 0.3 倍）和早期细胞凋亡（4.3 ± 0.8% 与 2.6 ± 0.1%）的减少来验证。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。与 DMSO 对照相比，Nec-1 的冷冻保护作用通过 RIP1 表达的降低（3.1 ± 0.2 倍与 1.3 ± 0.3 倍）和早期细胞凋亡（4.3 ± 0.8% 与 2.6 ± 0.1%）的减少来验证。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。在用 50 μM Nec-1 冷冻保存后，在 SSC 中观察到正常的功能活性。总之，坏死性凋亡可能是冷冻损伤的一个原因，它们的抑制剂可以作为潜在的有效冷冻保护剂。这项研究将有助于建立一种基于分子的冷冻保存方法，从而将 SSC 的使用扩展到国内畜牧业以及临床应用中。