Hydrogen/deuterium exchange monitored by mass spectrometry (HDX-MS) has become an important method to study the structural dynamics of proteins. However, glycoproteins represent a challenge to the traditional HDX-MS workflow for determining the deuterium uptake of the protein segments that contain the glycan. We have recently demonstrated the utility of the glycosidase PNGase A to enable HDX-MS analysis of N-glycosylated protein regions. Here, we have investigated the use of the acidic glycosidase PNGase H+, which has a pH optimum at 2.6, to efficiently deglycosylate N-linked glycosylated peptides during HDX-MS analysis of glycoproteins. Our results show that PNGase H+ retains high deglycosylation activity at HDX quench conditions. When used in an HDX-MS workflow, PNGase H+ allowed the extraction of HDX data from all five glycosylated regions of the serpin α1-antichymotrypsin. We demonstrate that PNGase A and PNGase H+ are capable of similar deglycosylation performance during HDX-MS analysis of α1-antichymotrypsin and the IgG1 antibody trastuzumab (TZ). However, PNGase H+ provides broader specificity and greater tolerance to the disulfide-bond reducing agent TCEP, while PNGase A offers advantages in terms of commercial availability and purity. Overall, our findings demonstrate the unique features of PNGase H+ for improving conformational analysis of glycoproteins by HDX-MS, in particular, challenging glycoproteins containing both glycosylations and disulfide bonds.

中文翻译：

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酸性糖苷酶 PNGase H+ 的去糖基化可通过氢/氘交换质谱法分析 N-连接的糖蛋白。

通过质谱 (HDX-MS) 监测的氢/氘交换已成为研究蛋白质结构动力学的重要方法。然而，糖蛋白对传统的 HDX-MS 工作流程提出了挑战，用于确定含有聚糖的蛋白质片段的氘摄取。我们最近证明了糖苷酶 PNGase A 的效用，可以对 N-糖基化蛋白质区域进行 HDX-MS 分析。在这里，我们研究了使用酸性糖苷酶 PNGase H+（其最佳 pH 值为 2.6）在糖蛋白的 HDX-MS 分析过程中有效地对 N 连接的糖基化肽进行去糖基化。我们的结果表明 PNGase H+ 在 HDX 淬灭条件下保持高去糖基化活性。在 HDX-MS 工作流程中使用时，PNGase H+ 允许从丝氨酸蛋白酶抑制剂 α1-抗胰凝乳蛋白酶的所有五个糖基化区域提取 HDX 数据。我们证明 PNGase A 和 PNGase H+ 在对 α1-抗胰凝乳蛋白酶和 IgG1 抗体曲妥珠单抗 (TZ) 进行 HDX-MS 分析期间能够具有类似的去糖基化性能。然而，PNGase H+ 对二硫键还原剂 TCEP 具有更广泛的特异性和更大的耐受性，而 PNGase A 在商业可用性和纯度方面具有优势。总体而言，我们的研究结果证明了 PNGase H+ 的独特功能，可通过 HDX-MS 改进糖蛋白的构象分析，特别是具有挑战性的同时含有糖基化和二硫键的糖蛋白。我们证明 PNGase A 和 PNGase H+ 在对 α1-抗胰凝乳蛋白酶和 IgG1 抗体曲妥珠单抗 (TZ) 进行 HDX-MS 分析期间能够具有类似的去糖基化性能。然而，PNGase H+ 对二硫键还原剂 TCEP 具有更广泛的特异性和更大的耐受性，而 PNGase A 在商业可用性和纯度方面具有优势。总体而言，我们的研究结果证明了 PNGase H+ 的独特功能，可通过 HDX-MS 改进糖蛋白的构象分析，特别是具有挑战性的同时含有糖基化和二硫键的糖蛋白。我们证明 PNGase A 和 PNGase H+ 在对 α1-抗胰凝乳蛋白酶和 IgG1 抗体曲妥珠单抗 (TZ) 进行 HDX-MS 分析期间能够具有类似的去糖基化性能。然而，PNGase H+ 对二硫键还原剂 TCEP 具有更广泛的特异性和更大的耐受性，而 PNGase A 在商业可用性和纯度方面具有优势。总体而言，我们的研究结果证明了 PNGase H+ 的独特功能，可通过 HDX-MS 改进糖蛋白的构象分析，特别是具有挑战性的同时含有糖基化和二硫键的糖蛋白。