Upon internalization, receptors are trafficked to sorting endosomes (SE) where they undergo sorting and are then packaged into budding vesicles that undergo fission and transport within the cell. Eps15 Homology Domain Protein 1 (EHD1), the best-characterized member of the Eps15 Homology Domain Protein (EHD) family, has been implicated in catalyzing the fission process that releases endosome-derived vesicles for recycling to the plasma membrane. Indeed, recent studies suggest that upon receptor-mediated internalization, EHD1 is recruited from the cytoplasm to endosomal membranes where it catalyzes vesicular fission. However, the mechanism by which this recruitment occurs remains unknown. Herein, we demonstrate that the EHD1 paralog, EHD4, is required for the recruitment of EHD1 to SE. We show that EHD4 preferentially dimerizes with EHD1, and knock-down of EHD4 expression by siRNA, shRNA or by CRISPR/Cas9 gene-editing leads to impaired EHD1 SE-recruitment and enlarged SE. Moreover, we demonstrate that at least 3 different asparagine-proline-phenylalanine (NPF) motif-containing EHD binding partners, Rabenosyn-5, Syndapin2 and MICAL-L1, are required for the recruitment of EHD1 to SE. Indeed, knock-down of any of these SE-localized EHD interaction partners leads to enlarged SE, presumably due to impaired endosomal fission. Overall, we identify a novel mechanistic role for EHD4 in recruitment of EHD1 to SE, thus positioning EHD4 as an essential component of the EHD1-fission machinery at SE.

内化后，受体被转运至分选内体（SE），在此接受分选，然后包装成芽囊泡，在细胞内进行裂变和运输。Eps15同源结构域蛋白（EHD）系列中最典型的成员Eps15同源结构域蛋白1（EHD1）与催化裂变过程有关，该过程释放了内体来源的囊泡，可循环回质膜。确实，最近的研究表明，在受体介导的内化作用之后，EHD1从细胞质中募集到内体膜，并在此催化囊泡裂变。但是，这种募集发生的机制仍然未知。在这里，我们证明了将EHD1募集到SE需要EHD1旁系同源物EHD4。我们显示EHD4优先与EHD1二聚，siRNA，shRNA或CRISPR / Cas9基因编辑导致EHD4表达下降并导致EHD1 SE招聘受损和SE增大。此外，我们证明，至少有3种不同的含有天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸（NPF）的EHD结合伴侣，Rabenosyn-5，Syndapin2和MICAL-L1，是将EHD1募集至SE所必需的。确实，这些SE定位的EHD相互作用伴侣中的任何一个的敲除都可能导致SE增大，这可能是由于内体裂变受损所致。总体而言，我们确定了EHD4在将EHD1募集至SE方面的新型机制作用，从而将EHD4定位为SE的EHD1裂变机械的重要组成部分。我们证明，至少有3种不同的含天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸（NPF）基序的EHD结合伙伴Rabenosyn-5，Syndapin2和MICAL-L1，是将EHD1募集至SE所必需的。确实，这些SE定位的EHD相互作用伴侣中的任何一个的敲除都可能导致SE增大，这可能是由于内体裂变受损所致。总体而言，我们确定了EHD4在将EHD1募集至SE方面的新型机制作用，从而将EHD4定位为SE的EHD1裂变机械的重要组成部分。我们证明，至少有3种不同的含天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸（NPF）基序的EHD结合伙伴Rabenosyn-5，Syndapin2和MICAL-L1，是将EHD1募集至SE所必需的。确实，这些SE定位的EHD相互作用伴侣中的任何一个的敲除都可能导致SE增大，这可能是由于内体裂变受损所致。总体而言，我们确定了EHD4在将EHD1募集至SE方面的新型机制作用，从而将EHD4定位为SE的EHD1裂变机械的重要组成部分。