Standardized parts can be efficiently assembled into novel biological systems using the three antibiotic (3A) system, ensuring the reusability of components and repeatability of experiments. In this study, we created the 3A expression system for easy construction of gene expression cassettes in Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), which was applied to screen combinations of promoters and signal peptides for improved secreted rhv3 production. We first obtained three strong promoters P2252, Podhi, and PyweA from all of promoters, which drive the highest expression of green fluorescent protein (egfp). The three promoters were then assembled with different signal peptides to generate a series of constructs using the 3A expression system developed in this study, from which the highest activity of rhv3 reached 3187.5 ATU/L of PyweA-CspA-rhv3. Further increased production of rhv3 achieved large-scale fermentation using 5-L jar bioreactor, with the highest rhv3 accumulation 1.21 g/L obtained after 40 h of cultivation, which is higher than 0.95 g/L reported in E. coli. To the best of our knowledge, this is the first report of rhv3 secretory expression in C. glutamicum, which could be applied for the production of other recombinant proteins with significant applications.Key points• We have exploited a 3A system for the genetic manipulation in C. glutamicum.• We constructed element libraries for assembling standard sequence in C. glutamicum.• The secreted expression of rhv3 was realized by 3A system in C. glutamicum.

中文翻译：

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从 BioBrick 部件构建 3A 系统，用于在谷氨酸棒杆菌中表达重组水蛭素变体 III。

标准化部件可以使用三抗生素 (3A) 系统高效组装成新型生物系统，确保组件的可重复使用性和实验的可重复性。在这项研究中，我们创建了 3A 表达系统，以便在谷氨酸棒杆菌 (C. glutamicum) 中轻松构建基因表达盒，该系统用于筛选启动子和信号肽的组合，以提高分泌的 rhv3 产量。我们首先从所有启动子中获得了三个强启动子 P2252、Podhi 和 PyweA，它们驱动绿色荧光蛋白 (egfp) 的最高表达。然后将三个启动子与不同的信号肽组装在一起，使用本研究开发的 3A 表达系统生成一系列构建体，其中 rhv3 的最高活性达到了 PyweA-CspA-rhv3 的 3187.5 ATU/L。使用 5-L 罐式生物反应器进一步提高 rhv3 的产量，实现了大规模发酵，培养 40 小时后获得的 rhv3 最高积累为 1.21 g/L，高于大肠杆菌中报道的 0.95 g/L。据我们所知，这是谷氨酸棒杆菌中 rhv3 分泌表达的第一份报告，可用于生产其他具有重要应用的重组蛋白。关键点• 我们利用 3A 系统进行基因操作谷氨酸棒杆菌。• 我们构建了用于在谷氨酸棒杆菌中组装标准序列的元件文库。• 谷氨酸棒杆菌中通过3A系统实现rhv3的分泌表达。高于大肠杆菌中报道的 0.95 g/L。据我们所知，这是谷氨酸棒杆菌中 rhv3 分泌表达的第一份报告，可用于生产其他具有重要应用的重组蛋白。关键点• 我们利用 3A 系统进行基因操作谷氨酸棒杆菌。• 我们构建了用于在谷氨酸棒杆菌中组装标准序列的元件文库。• 谷氨酸棒杆菌中通过3A系统实现rhv3的分泌表达。高于大肠杆菌中报道的 0.95 g/L。据我们所知，这是谷氨酸棒杆菌中 rhv3 分泌表达的首次报道，可用于生产其他具有重要应用的重组蛋白。关键点• 我们利用 3A 系统进行基因操作谷氨酸棒杆菌。• 我们构建了用于在谷氨酸棒杆菌中组装标准序列的元件文库。• 谷氨酸棒杆菌中通过3A系统实现rhv3的分泌表达。